Высокая пропускная измерения и классификации органических P в пробах окружающей среды

Общая цель данной процедуры заключается в классификации ферментативно гидролизуемого органического фосфора в экстрактах образцов почвы или навоза. Это достигается путем предварительного экстрагирования образцов раствором ЭДТА и гидроксида натрия с последующим доведением pH экстрактов до заданного значения. Затем эти скорректированные экстракты инкубируют с двумя различными растворами ферментов.

Заключительным этапом анализа на 96-луночном планшете является измерение количества ортофосфатов, высвобожденных ферментом, с помощью колориметрии с использованием молибден синего. В конечном итоге большинство природных форм моноэфиров и диэфиров фосфора в образцах почвы или навоза могут быть классифицированы на основе дифференциального высвобождения ортофосфата методом ферментативного гидролиза. Этот метод может быть недорого реализован в любой стандартной лаборатории.

Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как ядерный магнитный резонанс на ядрах фосфора 31, является возможность измерения потенциала нативных почвенных ферментов по высвобождению ортофосфата из органических соединений гороха в будущем. Таким образом, данные, полученные этим методом, могут помочь в прогнозировании плодородия почвы или потенциала почвы по высвобождению вредных количеств доступного для водорослей ортофосфата. Добавьте 30 milliliters 0.25 molar раствора гидроксида натрия к двум граммам влажного или высушенного образца в коническую пробирку объемом 50 milliliters.

Инкубируйте при перемешивании в течение 16 часов при комнатной температуре. Центрифугируйте образцы при 3000 ×g в течение 30 минут, затем перенесите 100 µL в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 mL, в которой уже находится ацетатный буфер. Доведенный до объема образец имеет общий объем 1 mL и pH 5.0.

Приготовьте два стоковых раствора, содержащих 0,5 единиц на миллилитр кислой фосфатазы, в 10 миллилитрах свежеприготовленного 0,1 молярного раствора ацетата натрия с pH 5. Затем добавьте реконструированную лиофилизированную нуклеазу NP1 из Penicillium Citron в одну из 10-миллилитровых пробирок со стоковым раствором кислой фосфатазы до конечной концентрации 2,5 единиц NP1 на миллилитр, аккуратно перемешав путем нескольких переворачиваний; центрифугируйте оба раствора фермента при 3000 ×g в течение 30 минут. Для построения калибровочного графика сначала добавьте 1 миллилитр 1 миллимолярного стокового раствора фосфата калия в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и выполните семь последовательных разведений по 0,5 миллилитра; первую пробирку отбросьте, чтобы конечный диапазон разведений составлял от 20 мкмоль до 0,625 нмоль фосфора.

Теперь перенесите стандарты ОРТОФОСФАТА в две последние колонки планшета, начиная с 0 nM ортофосфата в ряду A и заканчивая 20 nM ортофосфата в ряду H в первых трех лунках колонки 10. Добавьте 40 µL раствора ферментов PP и GP в следующие три лунки колонки 10. Добавьте 40 µL раствора одного фермента PP плюс GP плюс NP.

Наконец, добавьте 40 µL 100 мМ ацетатного буфера во все шесть лунок. Теперь в каждой из первых шести лунок в колонке 10 должно содержаться 80 µL раствора для следующих двух лунок. Добавьте 40 µL раствора ацетата натрия, содержащего 10 M глюкозы, шесть фосфатов, и 40 µL раствора ферментов PP и GP.

Для каждого тестируемого образца распределите по 40 µL экстрактов образцов с отрегулированным pH по лункам с первой по девятую вплоть до восьми рядов, после чего распределите все остальные образцы. С помощью многоканального дозатора внесите раствор ферментов PP и GP в колонки с первой по третью, раствор PP, GP и NP в колонки с четвертой по шестую и 0,1 M натрий-ацетатный буфер в колонки с седьмой по девятую. Выполните этот шаг быстро, чтобы обеспечить всем образцам эквивалентное время инкубации.

Накройте 96-луночный планшет крышкой и инкубируйте образцы, растворы фермента, контроли и калибровочную кривую ровно один час при 37 °C в деионизированной воде. Приготовьте по 50 мл каждого из четырех основных растворов. Раствор A необходимо готовить ежедневно, используя многоканальный пипетка, в быстром темпе.

Добавьте 25 µL SDS, 100 µL раствора A, 20 µL раствора B и 50 µL раствора C во все лунки 96-луночного планшета. Накройте планшет и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. В завершение измерьте абсорбцию при 850 nm на любом подходящем микропланшетном ридере, используя приложение для работы с электронными таблицами.

Сначала постройте калибровочную кривую для неорганического фосфора, где по оси X отложены значения от 0 до 20 нмоль фосфора, а по оси Y — средние значения дубликатов измерений абсорбции; проведите линейную регрессию и определите уравнение линии наилучшего соответствия. Затем рассчитайте фоновый уровень неорганического фосфора, вычислив среднее значение по столбцам с первого по третий, после чего примените калибровочную кривую к полученному набору данных. Далее, чтобы определить количество фосфора, образовавшегося в результате гидролиза моноэфиров фосфорной кислоты, вычислите среднее значение трипликатов образцов в столбцах с четвертого по шестой и вычтите из него значение контрольного раствора фермента и фонового уровня неорганического фосфора.

Затем, для расчета содержания фосфора по гидролизованному фосфору, DER вычисляют среднее значение трех повторностей образцов из колонок с седьмой по девятую и вычитают из него сумму значений контрольного раствора фермента, фонового неорганического фосфора и гидролизованного моноэфирного фосфора из колонок с четвертой по шестую. На типичном 96-луночном планшете представлены результаты для восьми образцов и калибровочная кривая. Контроли находятся в колонке 10.

Увеличение интенсивности окраски между первым и третьим столбцами обусловлено гидролизованными моноэфирными соединениями фосфора; между четвертым и шестым и между седьмым и девятым столбцами — гидролизованными диэфирными соединениями фосфора. В данной работе метод высокопроизводительного ферментативного гидролиза был успешно применен для анализа распределения классов фосфора в экстрактах образца почвы из Вермонта, полученных с помощью 0,25 М раствора гидроксида натрия и 0,05 М EDTA. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять содержание нативного ортофосфата, моноэфирных и диэфирных соединений фосфора в экстрактах почвы или навоза с использованием ферментативного гидролиза.

Данный метод может помочь исследователям в области химии окружающей среды и управления питательными веществами изучить поведение органического P в почвах или системах внесения навоза.