Высокая чувствительность 5-hydroxymethylcytosine Обнаружение в Balb / C ткани мозга

Общая цель следующего эксперимента заключается в анализе и количественном определении 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина в определенном локусе геномной ДНК. Это достигается путем блокирования гидроксильной группы 5-гидроксиметилцитозина, что превращает сайт рестрикции MspI в нераспознаваемый сайт. На втором этапе геномная ДНК подвергается воздействию рестриктаз MspI и HpaII, которые благодаря своей различной чувствительности к метилированию позволяют идентифицировать сайты 5-гидроксиметилцитозина.

Далее для исследования локуса используют ПЦР. В результате подтверждается наличие 5-гидроксиэтилцитозина в конкретном локусе. Для количественного определения содержания 5-метилцитозина и 5-гидроксиэтилцитозина может быть применена количественная ПЦР (кПЦР).

Основным преимуществом данного метода перед другими способами, такими как бисульфитное секвенирование, является возможность дифференцировать 5-метилцитозин и 5-гидроксиэтилцитозин. Эксперименты сегодня проведет Ромас Вайс Вилла; Ромас был основным разработчиком этого набора в New England Biolabs. Перед началом данного протокола выделите очищенную геномную ДНК из тканей головного мозга B. C. согласно описанной письменной процедуре. В реакционной пробирке объемом 1,5 мл смешайте геномную ДНК, UDP-глюкозу, буфер NEB 4 и достаточное количество воды, свободной от нуклеаз, чтобы довести общий объем до 310 µL.

Разделите эту реакционную смесь на две пробирки по 155 µL в каждую. Затем добавьте 30 units или 3 µL T4 β-глюкозилтрансферазы в одну из пробирок. Тщательно перемешайте, осторожно перенося жидкость пипеткой вверх и вниз.

Не добавляйте T4 BGT во вторую пробирку, так как она служит контрольной реакцией, но обязательно добавьте 3 µL воды. Инкубируйте обе пробирки при 37 °C от 12 до 18 часов; в течение этого времени BGT будет присоединять глюкозу к гидроксильной группе пяти гидроксиэтилцитозиновых групп в образце. Для начала переваривания рестриктазами перенесите по 50 µL реакционной смеси в каждую из трех ПЦР-пробирок стрипса объемом 0,2 мл, промаркированных цифрами от 1 до 3.

Затем распределите по 50 µL контрольной смеси в каждую из трех ПЦР-пробирок стрипа под номерами от четырех до шести. Добавьте 100 единиц msp в пробирки один и четыре. Далее добавьте 50 единиц HPA two в пробирки две и пять и тщательно перемешайте, осторожно дозируя жидкость пипеткой вверх и вниз.

Ничего не добавляйте в третью и шестую пробирки, так как они являются контрольными. Инкубируйте все шесть пробирок при 37 °C в течение как минимум четырех часов. Затем добавьте по 1 µL протеиназы K в каждую пробирку и инкубируйте при 40 °C в течение 30 минут.

Наконец, инактивируйте протеиназу K, инкубируя пробу при 95 °C в течение 10 минут. Данная процедура продемонстрирована с использованием NE B'S long amp TAC для конечной ПЦР. Однако другие реагенты и протоколы ПЦР могут быть использованы в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл на льду.

Добавьте 5 x длинный amp TAC реакционный буфер, dNTP, прямые и обратные праймеры, ранее полученную матричную ДНК, long AMP T-ДНК-полимеразу и достаточное количество воды, свободной от нуклеаз, чтобы достичь конечного объема 50 µL. Осторожно перемешайте реакционную смесь; при необходимости осадите всю жидкость на дно пробирки с помощью кратковременного центрифугирования. Перенесите ПЦР-пробирки со льда в термоциклер с блоком, предварительно нагретым до 94 °C, и запустите программу циклирования для стандартной трехстадийной ПЦР.

Сначала следует провести один этап начальной денатурации при 94 °C в течение 30 секунд, затем 30 циклов, состоящих из денатурации при 94 °C в течение 15 секунд, отжига при температуре от 55 до 65 °C в течение 30 секунд и элонгации при 65 °C в течение 20 секунд или 50 секунд на каждый kb. После этого следует провести одну финальную элонгацию при 65 °C в течение пяти минут. Также может быть выполнена ПЦР в реальном времени для количественного определения содержания 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина.

Для получения конкретной информации, пожалуйста, обратитесь к руководству по эксплуатации продукта на сайте nb.com. Сравнение содержания пяти гидроксиэтиламинов в локусе 12 было проведено с использованием ПЦР с определением конечной точки и ПЦР в реальном времени; были проанализированы четыре различных образца тканей мышей BSY, включая мозг, печень, сердце и селезенку.

Вариации содержания 5-гидроксиэтилцитозина видны на выделенной рамкой дорожке геля с образцами ПЦР конечной точки, представленными для сравнительного анализа. Данные ПЦР в реальном времени были нормализованы по нерасщепленной ДНК, а для определения числа копий использовалась стандартная кривая. Образцы были нормализованы путем деления числа копий в образцах на число копий в нерасщепленном контроле.

Здесь вариации содержания 5-гидроксиэтилцитозина можно увидеть, сравнив желтые столбцы. Несколько примечаний по выполнению данной методики. Критически важно, чтобы все ферментативные реакции были доведены до завершения. Для BGT важно проводить инкубацию в течение ночи, чтобы вы могли полностью изолировать все сайты ДНК для Ms.P one и HEPA two; для этих реакций важно выждать не менее четырех часов, чтобы убедиться в их полном завершении.

И наконец, мы предоставляем контроли ДНК и контроли праймеров, чтобы вы могли проводить контрольные реакции параллельно.