Точные и простые измерения провоспалительных цитокинов IL-1β использованием Всего Пробирная стимуляция крови
1 марта 2011 г.
Мы опишем простой иммуноанализа для измерения производство провоспалительных цитокинов, таких как IL-1 бета производства, у пациентов с autoinflammatory фенотипы. При активации клеток в целом посевы крови с возбудителем связанные молекулярные модели, в частности, с липополисахарид, секрецию цитокинов может быть удобно оценивать в целом супернатанты крови.
Общая цель данной процедуры заключается в измерении уровня провоспалительных цитокинов, вырабатываемых в ходе анализа стимуляции цельной крови. Сначала клеточные компоненты цельной крови отделяют от плазмы путем центрифугирования, после чего проводят подсчет лейкоцитов с использованием окрашивания аниловым оранжевым. Затем клетки высевают и стимулируют LPS с последующим добавлением TP для индукции продукции цитокинов клетками, имеющими рецепторы распознавания патогенов; после начала стимуляции супернатанты культур собирают в определенные временные точки.
Наконец, концентрации цитокинов в супернатантах измеряют с помощью мультиплексного анализа в 96-луночном планшете. Используя этот простой метод, можно быстро оценить различия в концентрациях провоспалительных цитокинов, вырабатываемых стимулированными клетками от разных доноров. Данный метод особенно полезен для выявления воспалительных заболеваний, опосредованных IL-1, у пациентов с патологическими проявлениями воспаления, особенно в условиях ограниченного объема доступной крови.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами измерения концентрации цитокинов является то, что технология на базе Luminex позволяет одновременно измерять уровни нескольких цитокинов, используя при этом небольшой объем образца. Получите образцы венозной крови объемом 10 миллилитров или более от обследуемых лиц, а также от здоровых лиц контрольной группы, подходящих по возрасту и полу; убедитесь, что образцы собраны в вакутайнеры с натрий-гепарином, и что ЭДТА или другие антикоагулянты не добавлялись, так как они будут мешать проведению анализа; обработайте образцы как можно скорее после сбора. При необходимости образцы можно хранить до 24 часов при комнатной температуре в условиях приглушенного освещения.
Центрифугируйте образцы крови при 3000 RPM в течение 10 минут при комнатной температуре с отключенным торможением. После центрифугирования аккуратно снимите плазму с поверхности пробирок, стараясь не задеть слой лейкоцитов (buffy coat), содержащий мононуклеарные клетки. Ресуспендируйте слой лейкоцитов и лежащий под ним осадок эритроцитов в безсывороточной среде RPMI при комнатной температуре, осторожно перемешивая смесь пипетированием для промывки клеток.
Затем перенесите клетки из пробирки для сбора в коническую пробирку объемом 50 мл. Доведите объем до 50 мл с помощью среды RPMI и осторожно переверните каждую пробирку для перемешивания. Центрифугируйте клетки еще раз при 3000 RPM в течение 10 минут.
Затем аспирируйте супернатант, стараясь не задеть осадок клеток. Повторите этот этап промывки от двух до четырех раз, чтобы удалить загрязнения и связанные с клетками цитокины. После промывки клеток ресуспендируйте их в безсывороточной среде RPMI до общего объема 20 мл. Для подсчета клеток нанесите 20 мкл смеси образца и акридина оранжевого в соотношении 1:1 в одноразовую камеру Собера. Акридин оранжевый при конечной концентрации 1 мкг/мл окрашивает только имеющие ядро лейкоциты, что позволяет дифференцировать их от эритроцитов.
После получения общего количества клеток подсчитайте только D-положительные клетки. Ресуспендируйте образцы в среде RPMI без сыворотки, чтобы достичь конечной концентрации 2 миллионов клеток на мл. Для каждого образца маркируйте дублирующие лунки 24-луночного планшета в соответствии с тестируемыми экспериментальными условиями.
В данном случае предусмотрены следующие условия: без стимуляции, только LPS, только a TP и LPS совместно с a TP. Добавьте по одному миллилитру разведенных клеток в каждую лунку и добавьте LPS в соответствующие лунки до конечной концентрации 1 µg/mL. Инкубируйте образцы при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 в течение двух часов 40 минут. После этого начального периода инкубации добавьте a TP до конечной концентрации 2 mM в лунки с только a TP и LPS совместно с a TP. Затем инкубируйте планшеты еще в течение 20 минут при 37 °C.
По завершении второй инкубации перенесите клетки из каждой лунки в отдельные предварительно промаркированные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, центрифугируйте образцы при 10,000 RRP M в течение двух минут при комнатной температуре, затем перенесите супернатант из каждой пробирки в новую предварительно промаркированную пробирку для EOR. Супернатант можно подвергнуть анализу на содержание цитокинов сразу или хранить в замороженном виде для последующего определения концентраций IL one beta или других цитокинов. Для анализа образцов мы используем набор Bio Plex Pro, Human Cytokine X Plex с системой Bio Plex 200.
Согласно инструкциям производителя. На данном рисунке анализ продукции IL-1β при стимуляции нормальных клеток цельной крови LPS, ATP или обоими стимулами вместе демонстрирует ответ на LPS плюс ATP, величина которого зависит от количества стимулируемых клеток. В отличие от здорового контроля, анализы цельной крови пациентов с аутовоспалительными патологиями выявляют повышенную продукцию IL-1β после стимуляции LPS в отсутствие экзогенно добавленного ATP. Не забывайте, что работа с биологическими жидкостями человека, такими как кровь, может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать универсальные меры предосторожности.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается простой метод иммуноанализа для измерения уровней провоспалительных цитокинов, в частности IL-1 бета, у пациентов с аутовоспалительными фенотипами. Метод заключается в стимуляции культур цельной крови липополисахаридом для оценки секреции цитокинов в супернатантах.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клинические исследования
- Воспалительные заболевания
Обзор
- Провоспалительные цитокины играют ключевую роль при аутовоспалительных заболеваниях.
- Измерение уровней цитокинов может помочь в диагностике воспалительных состояний.
- Анализы стимуляции цельной крови представляют собой практический подход к таким измерениям.
- Патоген-ассоциированные молекулярные паттерны могут эффективно активировать иммунный ответ.
Цель исследования
- Разработать простой метод оценки продукции цитокинов.
- Обеспечить возможность быстрой оценки вариаций уровней цитокинов у различных доноров.
- Оказать помощь в выявлении воспалительных заболеваний, опосредованных IL-1.
Используемые методы
- Выделение клеточных компонентов из цельной крови путем центрифугирования.
- Подсчет количества лейкоцитов с использованием метода окрашивания красителем.
- Стимуляция клеток липополисахаридом (LPS).
- Сбор супернатантов в определенные моменты времени для анализа.
- Измерение концентрации цитокинов с помощью мультиплексного анализа в 96-луночном планшете.
Основные результаты
- Данный метод позволяет быстро оценить концентрацию цитокинов.
- Различия в продукции цитокинов могут наблюдаться у разных доноров.
- Этот подход особенно полезен при ограниченном объеме крови.
- Он способствует выявлению воспалительных заболеваний с противовоспалительными проявлениями.
Выводы
- Разработанный иммуноанализ эффективен для измерения провоспалительных цитокинов.
- Данный метод может расширить понимание аутовоспалительных заболеваний.
- Он представляет собой ценный инструмент для клинических исследований в области иммунологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный анализ стимуляции цельной крови позволяет быстро измерять низкие объемы провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, что способствует ранней валидации мишеней при исследовании аутовоспалительных заболеваний. Путем количественного определения секреции цитокинов стимулированными клетками врожденного иммунитета данный метод дает понимание механизмов, которое помогает снизить риски терапевтических гипотез и приоритизировать доклинических кандидатов. Совместимость с мультиплексным детектированием и минимальные требования к объему образцов повышают доступность скрининга биомаркеров и стратификации пациентов в программах поиска новых лекарств в области иммунологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Измерение секреции IL-1β для функциональной валидации активации инфламмасомы в качестве терапевтической мишени в путях врожденного иммунитета.
- Практическая ценность: Использование цельной крови для сохранения физиологических взаимодействий клеток, что повышает релевантность данных о взаимодействии с мишенью по сравнению с системами изолированных клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет проводить количественное мультиплексное определение цитокинов в стимулированной цельной крови, что способствует стандартизации анализа для профилирования цитокинов.
- Практическая ценность: требуется всего 10 mL крови и исключается этап изоляции клеток, что повышает пропускную способность и снижает преаналитическую вариабельность в рабочих процессах скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет выявить индивидуальную гиперреактивность пациентов на LPS, что способствует стратификации когорт с аутовоспалительными заболеваниями для проведения терапевтического тестирования на основе конкретных механизмов.
- Практическая ценность: метод работает с ограниченными объемами образцов, что позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг в доклинических моделях или при ранних фазах клинических исследований, где доступность крови ограничена.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в процесс разработки препаратов, обеспечивая функциональные иммунологические показатели после взаимодействия с мишенью, но до этапа оптимизации ведущих соединений, что помогает связать фенотипический скрининг с механистическим снижением рисков.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о цитокиновом выбросе, зависящем от инфламмасомы, что позволяет уточнить вклад конкретных путей в развитие воспаления.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели уровня цитокинов, позволяющие сравнивать условия стимуляции и эффекты соединений в мультиплексном формате.
- Аналитика: Позволяет определять концентрации цитокинов в супернатанте с помощью мультиплексного анализа на системе Luminex, что обеспечивает многопараметрическое иммунное профилирование при ограниченном объеме образцов.
- Трансляционные исследования: Связывает активацию врожденного иммунитета с ответами, полученными от пациентов, поддерживая переход от этапа открытия к доклинической валидации на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает стандартизированный протокол стимуляции и считывания результатов, применимый в рамках программ по изучению иммуноопосредованных заболеваний и кампаний по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени, связывая стимуляцию LPS с высвобождением IL-1β в физиологически релевантном контексте.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированного подсчета клеток, времени стимуляции и сбора супернатанта, что снижает дрейф анализа.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления чрезмерных цитокиновых ответов, что снижает биологические риски на поздних этапах разработки иммуномодуляторов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию соединений с учетом рисков, основываясь на их способности модулировать специфическую для пациента активность инфламмасомы в цельной крови.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с иммунными клетками, владение методами анализа цитокинов и соблюдение правил работы в лабораториях уровня биобезопасности 2 при обработке крови человека.
- Требуется наличие центрифуг, камер для подсчета клеток (например, гемоцитометра или автоматического счетчика), инкубаторов и систем мультиплексного определения цитокинов, таких как Luminex или Bio-Plex.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов стимуляции (время воздействия и концентрации LPS/ATP), а также правил работы с супернатантом для обеспечения сопоставимости данных между различными центрами.
- Адаптация для нечеловеческих модельных систем может потребовать валидации видоспецифичных ответов на LPS и ATP, а также проверки перекрестной реактивности реагентов для детекции.
- Практические ограничения включают требование по хранению образцов при комнатной температуре не более 24 часов и необходимость своевременной обработки для предотвращения деградации цитокинов ex vivo или возникновения артефактов активации клеток.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Collection of Whole Blood
2:02
Preparation of Whole Blood
3:53
Stimulation of the Whole Blood
5:15
Cytokine Assay
5:34
Over-Production of IL-1B in Whole Blood from Patients with Autoinflammatory Manifestations in Response to Stimulation with LPS in the Presence of ATP
6:08
Conclusion
