Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Общая цель следующего эксперимента заключается в измерении термодинамических параметров, связанных с фолдингом мембранного белка. Для этого сначала собирают малые везикулы LAR, чтобы создать среду фолдинга для мембранного белка. После приготовления везикулы используются для подготовки образцов, содержащих белок и систематически варьируемые концентрации мочевины.

Затем измеряют спектр флуоресценции триптофана для каждого образца. Для сбора данных, необходимых для построения кривой развертывания мембранного белка, получают результаты, показывающие, как можно рассчитать свободную энергию Гиббса развертывания мембранного белка на основе кривых развертывания, полученных по спектрам флуоресценции триптофана. Здравствуйте, меня зовут Джуди Ким. Я доцент Калифорнийского университета в Сан-Диего.

Метод, который вы сейчас увидите, раскрывает важное свойство мембранных белков. В частности, мы продемонстрируем, как измерить стабильность белка, который свернут и встроен в липидный бислой. Меня зовут Диана Оттингер, я аспирантка химического факультета Калифорнийского университета в Сан-Диего.

Сегодня мы продемонстрируем этот метод на примере репрезентативного мембранного белка. Однако данная методика является универсальной и может быть применена к другим биологическим системам, таким как мембранно-ассоциированные пептиды и растворимые белки. Итак, приступим.

Перед началом выполнения данного протокола приобретите раствор 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DMPC) в хлороформе и разлейте его по чистым стеклянным флаконам. При дозировке 20 mg на флакон добавьте в каждый флакон слой газообразного азота для предотвращения окисления липидов и герметично закройте их. Для каждого эксперимента используется один флакон, содержащий 20 mg липида в хлороформе.

Для приготовления основного раствора везикул начните с высушивания содержимого флакона в потоке газообразного азота в течение одного часа, используя тефлоновую перегородку и иглы, до полного удаления растворителя. Добавьте один миллилитр 20 мМ калий-фосфатного буфера, pH 7.3, к высушенным липидам и ресуспендируйте в водяной бане в течение примерно 30 секунд. Перенесите полученную мутную суспензию в пластиковую пробирку объемом 15 мл с коническим дном с помощью пипетки.

Добавьте еще 1 мл фосфатного буфера в пустой стеклянный флакон, в котором изначально находился липид, и повторите соникацию. Перенесите полученную суспензию в ту же пробирку объемом 15 мл. Повторите этот процесс в общей сложности четыре раза, чтобы получить конечный объем 4 мл и концентрацию липида 5 мг/мл.

Поместите суспензию липидных везикул в теплую водяную баню и подвергните воздействию ультразвука с помощью микронаконечника ультразвукового анализатора в течение одного часа при 50% рабочем цикле. Водяная баня служит для предотвращения перегрева липидного раствора и поддержания температуры водного липидного раствора выше температуры фазового перехода бислоя во время соникации.

Профильтруйте ОНОВОЧЕННЫЙ раствор через шприцевой фильтр с порами 0,22 мкм, чтобы удалить частицы от наконечника атора, и оставьте отфильтрованный раствор для уравновешивания на ночь при 37 °C. Для подготовки образца к начальному флуоресцентному разворачиванию приготовьте стоковый раствор 10 M мочевины в 20 мМ фосфатном буфере и стоковый раствор 20 мМ фосфатного буфера. Согласно письменному протоколу, концентрацию мочевины следует определить экспериментально, измерив показатель преломления с помощью рефрактометра и сравнив его с известными значениями.

Затем приготовьте стоковый раствор развернутого белка с концентрацией примерно 200 µM белка в 8 M мочевине и 20 mM фосфатном буфере. В данном видео для демонстрации протокола используется мембранный белок OPA A; образцы для флуоресцентных исследований готовят путем смешивания соответствующих объемов стокового раствора белка, стокового раствора липидов, стокового раствора 10 M мочевины и стокового фосфатного буфера для получения образцов, содержащих примерно 4 µM белка, 1 mg/mL липида и от 0 до 8 M мочевины с шагом 1 M, при общем объеме 200 µL. Холостые образцы готовят аналогичным образом.

Однако вместо белка добавляют 4 µL 8 M раствора мочевины. Такие холостые пробы используются для вычитания сигналов рассеяния и фона, которые проявляются в флуоресцентных спектрах белка. Инкубируйте образцы белка и холостые пробы при 37 °C не менее двух часов перед измерением флуоресцентных спектров.

Для обеспечения полного фолдинга включите флуориметр за один час до начала измерений. Мембранные белки, как правило, встраиваются в синтетические липиды только при температуре выше температуры фазового перехода бислоя. Следовательно, в случае с DMPC температура держателя образцов во флуориметре устанавливается на 30 °C.

Настройте эксперимент по флуоресценции на стационарном флуориметре и измерьте флуоресценцию триптофана каждого образца относительно холостой пробы. Длину волны возбуждения следует установить на 290 нанометров, чтобы избежать возбуждения остатков тирозина, а эмиссионный спектр регистрировать в диапазоне от 305 до 500 нанометров. Используйте ширину щелей возбуждения и детектирования три нанометра.

Шаг изменения длины волны и время интегрирования могут быть оптимизированы для достижения наилучшего соотношения сигнал/шум. Типичные значения шага длины волны и времени интегрирования составляют 1 нм на шаг и 0,5 с на шаг соответственно. Пипеткой перенесите 200 µL образца в микрообъемную кювету из плавленого кварца объемом 160 µL и поместите кювету в держатель кювет прибора.

Наконец, для проведения флуоресцентных измерений загрузите лист данных XY со спектрами флуоресценции в такое программное обеспечение, как Igor Pro, MATLAB, Origin или Excel. В данной демонстрации будет использоваться Igor Pro для удаления фона мочевины и липидных везикул, умножения спектра флуоресценции холостой пробы на скаляр S и вычитания полученного значения из необработанного спектра флуоресценции раствора белка с липидами. Для соответствующей концентрации мочевины определите по скорректированному спектру длину волны максимальной флуоресценции или lambda max.

Для каждой концентрации мочевины. Типичное значение для полностью развернутого мембранного белка составляет 350 нанометров. В то время как для свернутого белка оно составляет примерно 330 нанометров, переведите табличные значения длин волн в долю развернутого белка, преобразовав диапазон значений lambda max в диапазон от нуля до одного, соотнося значение lambda max с долей развернутой популяции.

Затем постройте график зависимости доли развернутого белка от концентрации мочевины. График зависимости доли развернутого состояния F от концентрации мочевины C можно аппроксимировать уравнением, исходя из предположения, что белок может находиться либо в свернутом, либо в развернутом состоянии. Коэффициент M соответствует скорости изменения свободной энергии относительно концентрации денатуранта, а CM соответствует средней концентрации мочевины, при которой популяция свернутых молекул равна популяции развернутых.

R — универсальная газовая постоянная, T — температура в Кельвинах. В результате процедуры аппроксимации определяются значения коэффициентов m и cm.

Эти коэффициенты перемножаются для определения delta G — энергии Гиббса разворачивания в отсутствие мочевины. Описанная кривая разворачивания показывает диапазон концентраций мочевины, вызывающий наибольшее изменение lambda max. Этот диапазон обычно узок, и большая часть процесса разворачивания происходит именно в этом интервале, что позволяет точно определить свободную энергию разворачивания.

В этой области следует проанализировать дополнительные образцы, чтобы получить график с достаточным количеством точек данных, необходимым для оптимизированного метода наименьших квадратов. Например, если белок разворачивается при концентрации мочевины от 2 до 4 M, можно подготовить образцы с шагом 0,2 M в этом диапазоне, чтобы более точно определить форму этого важного участка кривой разворачивания. Для достижения наилучших результатов следует включать холостой образец как минимум через каждые 0,5 M и через каждые 0,2 M.

Свободная энергия развертывания, полученная по этому графику, может несколько отличаться от значения, полученного по исходной кривой развертывания, однако она отражает более точное значение. Здесь представлены спектры флуоресценции триптофана репрезентативного мембранного белка om a, содержащего один остаток триптофана. Согласно протоколу, из необработанных спектров флуоресценции белка вычли необработанный спектр флуоресценции холостой пробы, в результате чего был получен скорректированный спектр.

На данном графике представлены скорректированные спектры флуоресценции триптофана мембранного белка при различных концентрациях мочевины, полученные с помощью описанных методов. В данной демонстрации была построена кривая развертывания исходя из предположения, что белок находится либо в свернутом, либо в развернутом состоянии, и что промежуточных стабильных состояний не существует. Параметр M отражает количество полипептида, доступного для растворителя при развертывании, в то время как CM является важным значением, описывающим концентрацию денатуранта, необходимую для достижения равного соотношения популяций свернутого и развернутого белка.

Высокие значения CM и M указывают на стабильность белка. Свободная энергия Гиббса развертывания для OPA a при использовании данной процедуры составила 6,2 kilo calories per mole. Для получения аналогичной информации о термодинамике фолдинга белков могут быть использованы другие методы развертывания, такие как воздействие температуры, изменение pH или применение других химических денатурантов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять стабильность белка, основываясь на различных флуоресцентных свойствах свернутого и развернутого состояний. В качестве альтернативы вы можете построить кривую развертывания с помощью других методов, таких как круговой дихроизм, при условии, что выбранный метод позволяет судить о конформации белка, независимо от используемого аналитического инструмента. Метод построения кривых развертывания универсален и может быть применен к широкому спектру мембранных и растворимых белков.