Иммуноцитохимическая: Человеческие нервные стволовые клетки

Привет, меня зовут Стив. Я работаю в лаборатории доктора Фланагана на кафедре патологии в Калифорнийском университете в Ирвине. И сегодня я покажу вам, как проводить иммунохимию нервных клеток-предшественников человека.

Этот протокол включает в себя помещение клеток на покрытые покрытием покровные листы, блокирование и инкубацию клеток в первичных антителах на ночь, а затем выполнение нескольких процедур и введение вторичных антител при комнатной температуре. И, наконец, крепление крышки скользит по пролетам микроскопа. Давайте начнем.

Итак, сначала я собираюсь поместить три стерильные немецкие стеклянные крышки диаметром 12 миллиметров в 24-луночную пластину, чтобы покрыть их ламинатом. Итак, теперь у меня есть покровные стекла в пластине, и сначала я собираюсь добавить раствор полилизина PDL, и я собираюсь инкубировать покровные сабвуферы в PDL в течение пяти минут при комнатной температуре. Итак, по истечении пяти минут, я собираюсь удалить PDL и нанести ламинин, и я собираюсь инкубировать покровные стекла в ламинате в течение как минимум четырех часов или лучше в течение ночи.

Итак, я инкубировал пластину в течение ночи в ламинат, и теперь я собираюсь промыть покровные листы PBS и наложить человеческие нервные клетки-предшественники, которые я уже посчитал. Поэтому я только что удалил растворы ламината и теперь собираюсь обуздать защитные стекла с помощью PBS. Итак, теперь я собираюсь удалить PBS и поставить раствор для мультимедиа.

И, наконец, я готов увидеть клетки. Итак, я собираюсь увидеть ячейки на уровне ста тысяч ячеек на мельницу, что означает, что для 24-луночной пластины я собираюсь добавить 50 000 ячеек на лунку, потому что каждая лунка содержит полмиллилитра. Поэтому я собираюсь наклонять пластину из стороны в сторону, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределены по поверхности крышки.

И теперь я собираюсь поместить их в инкубатор по крайней мере на 24 часа, чтобы они успокоились и распространились для иммунохимии. Итак, клетки росли в течение 24 часов, и я посмотрел на них, и они прикреплены и хорошо распределены. Так что теперь я собираюсь зафиксировать их с 4% высоты в течение пяти минут.

Но сначала я собираюсь удалить среду, и я не хочу, чтобы клетки высохли. Поэтому я собираюсь удалить носитель и одновременно добавить фиксатор. Так что это называется техникой двух рук.

Итак, теперь я собираюсь инкубировать клетки в фиксаторе в течение пяти минут при комнатной температуре. Итак, прошло пять минут. Я собираюсь удалить PFA и поместить его в контейнер для отходов PFA, и добавить PBS, одновременно удаляя PFA, чтобы клетки не высыхали.

Итак, я собираюсь использовать одну из этих пластиковых всасывающих пипеток для подтягивания PFA и установить таймер на пять минут. Итак, пока мои клетки находятся в промывке PBS, я собираюсь приготовить решение для визуализации пермы с помощью Triton X 100. Это неионогенное моющее средство, и оно очень, очень вязкое.

Поэтому важно дождаться, пока весь раствор поступит и попадет в пипетку. Итак, я собираюсь приготовить 0,3% раствор в PBS, я собираюсь добавить 10 мил PBS. И к этим 10 милам PBS я собираюсь добавить 30 микролитров tri следующие 100.

Итак, я собираюсь добавить 30 микролитров tri следующие 100-10 мил PBS. Поэтому я добавлю около 10 секунд, чтобы все растворы вошли в наконечник. Итак, у меня есть мое решение по утилизации perme.

Я надеваю его на вращатель на 10 минут, а затем делаю его вихревым, чтобы убедиться, что вязкий триттон полностью растворился. Итак, теперь я готов к этапу визуализации пермы. И поэтому я собираюсь в течение пяти минут при комнатной температуре.

Итак, прошло пять минут. Сейчас я собираюсь сделать три пятиминутных промывки PBS, чтобы убедиться, что смыл весь тритон. Итак, еще раз, я собираюсь установить часы на пять минут.

Итак, я только что закончил все этапы стирки, поэтому я готов выполнить этап блокировки. Итак, для шага блокировки я подготовил решение 5% BSA в PBS. И, как и в случае со всеми стирками, я собираюсь удалить PBS и одновременно добавить раствор для блокировки.

И этап блокировки будет продолжаться в течение одного часа при комнатной температуре. Итак, пока мои клетки блокируются, я собираюсь подготовить планшет к первичной инкубации антител. Итак, я начну со стеклянной пластины, и я собираюсь вырезать кусок парапленки примерно такого размера.

И что я собираюсь сделать, так это обернуть его, и мне понадобится немного скотча, так что мне понадобится четыре куска скотча. Так что я просто собираюсь подготовить их все. Итак, я собираюсь взять этот кусок парапленки и выпрямить его, чтобы поверхность была красивой и гладкой.

И затем я собираюсь взять каждый конец и прикрепить его скотчем к задней части стеклянной пластины. Итак, теперь я собираюсь потянуть за другой конец, чтобы убедиться, что поверхности прямые, и я собираюсь прикрепить другой конец к задней части. Итак, теперь мне нужен еще один кусок парной пленки того же размера, что и первый.

И в принципе я собираюсь сделать то же самое. Итак, я приклеил второй кусок пара-пленки поверх первого, точно так же, как и перфиль, за исключением того, что я оставил один конец второго куска перфила свободным, потому что я собираюсь поместить раствор антитела, а затем силовые промахи на первый кусок. А затем я собираюсь положить поверх него вторую часть, из которой получится бутерброд.

Но прямо сейчас я собираюсь пометить место, куда я собираюсь поместить раствор антитела, и крышку. Итак, клетки находятся в блокирующем растворе уже час, и я собираюсь надеть защитные листочки на капли первичного антитела для ночной инкубации. Итак, я собираюсь поместить каплю в 35 микролитров первичного антитела, и я буду очень осторожен, чтобы не вытолкнуть всю жидкость, потому что это может привести к образованию пузырьков, а пузырьки могут помешать связыванию антитела с антигеном.

Так что я хочу постараться избежать попадания пузырьков в капли, все три капли первичного антитела, и я готов, чтобы на эти капли наложить крышку, крышку с клетками. Итак, что я сейчас собираюсь сделать, так это взять обложку. Итак, сначала я собираюсь сдвинуть крышку в сторону и попытаться аккуратно поднять ее с открытым пинцетом.

Как только я почувствую, что ухватился за крышку, я собираюсь медленно закрыть пинцет и осторожно вытащить крышку из колодца. Таким образом, ячейки прямо сейчас находятся поверх покровного стекла. Итак, что я собираюсь сделать, так это перевернуть, аккуратно коснуться капли и медленно положить ее поверх капли, не создавая никаких пузырей.

И поэтому я собираюсь повторить ту же процедуру со вторым и третьим покровными листами. И последний шаг - поместить второй кусок парапленки сверху. И я собираюсь сделать это так: я собираюсь записать его одним движением вот так.

Хочу стараться избегать перемещения, передвигая его из стороны в сторону. И, наконец, я собираюсь закрепить его на дне пластины с помощью еще одного куска скотча. И теперь, наконец, клетки готовы к инкубации при температуре четыре градуса за ночь, и это конец первого дня иммунохимии.

Это второй день иммунохимии, и я собираюсь постирать чехлы в PB S3 раза в течение пяти минут. А затем я собираюсь инкубировать во вторичном антителе в течение двух часов при комнатной температуре. Во-первых, я собираюсь разрезать пара-пленку таким образом, чтобы я мог удалить защитные накладки.

И я собираюсь медленно поднять верхний кусок парапленки, чтобы защитные стекла остались на нижнем куске пленки для ухода. Итак, я снял первую часть, и у меня готова тарелка с моющим раствором PBS. Итак, я собираюсь поднять каждый суп и поместить его в лунку, чтобы смыть все оставшиеся первичные антитела, которые не прикрепились к эпитопу.

Итак, чтобы поднять чехол, я сначала возьму его вот так лезвием бритвы и просто осторожно попытаюсь поднять. И поскольку клетки есть, мы сталкиваемся с раствором антитела, я собираюсь перевернуть их так, чтобы они были наверху, и сгенерировать слайд в лунку, чтобы там все еще оставалось сверху. И я собираюсь повторить процедуру для оставшихся промахов.

И так их будут мыть в течение пяти минут. Итак, прошло пять минут. Я собираюсь заменить решение PBS.

Я собираюсь добавить крючки для кубиков. Теперь я собираюсь инкубировать его в течение пяти минут. На этом инкубация крючков закончена, и теперь я готов монтировать чехлы и смотреть на них.

Итак, сначала я собираюсь использовать четырехвекторный щит, который помогает защитить флуоресцентные пятаки от обесцвечивания. Я собираюсь, ну, сначала я помечу слайд номерами защитных листков, а затем я собираюсь поместить 10 микролитров векторного щита. Vector shield - это масло, и оно действительно вязкое, поэтому также важно немного подождать, пока оно все войдет в наконечник.

Итак, я поместил векторный экран на предметное стекло микроскопа, и теперь я готов надеть защитные стекла на предметное стекло микроскопа. Итак, что я собираюсь сделать в первую очередь, это взять крышку и промыть обратную сторону крышки деионизированной водой, потому что если я этого не сделаю, когда она высохнет, соль, которая была в PBS, кристаллизуется и будет мешать оптическим свойствам флуоресцентных штампов. Итак, я собираюсь, у меня уже готова деионизированная вода.

Итак, я собираюсь взять крышку и промыть ее заднюю часть деионизированной водой. А затем я прикоснусь к оловянной салфетке, чтобы высушить его. И затем я собираюсь снова инвертировать его так, чтобы клеточная сторона была инвертирована и опустилась на предметное стекло микроскопа.

И так же, как и раньше, я коснусь капли векторного щита и медленно опустю ее, не захватывая пузыри. И я собираюсь повторить ту же самую процедуру, для всех переворотов груза. А теперь давайте посмотрим.

Это пример того, что вы можете получить после иммунохимии и получения фотографий, наложения и тому подобного. Итак, на этом изображении, на этом, на этом изображении нейростволовых клеток гиппокампа, выделенных из зубчатых стволов у постнатальных мышей. Сегодня я показал вам, как проводить иммунохимию нервных клеток-предшественников человека.

И если вы заметите, этот метод позволяет вам сэкономить обширный реагент антител. Мы использовали очень малый объем первичного и вторичного антитела, поместив небольшую каплю на перфил и инвертировав покровный лист с клетками поверх него. Так что продолжайте, занимайтесь иммунотерапией, и спасибо, что наблюдаете за мной.