Β-глюкуронидазы (GUS) Основываясь Анализ гибели клеток

Общая цель данной процедуры заключается в использовании репортерной системы Gus для анализа потенциальных летальных свойств специфических генов. Интересующие гены клонируются в кассету Gus и экспрессируются в соответствующих векторах агробактерий под управлением промотора 35 s. Затем эти векторы трансформируют в штамм Agrobacterium LBA 44 0 4 и смешивают с культурой, содержащей экспрессионную кассету Gus, для инокуляции листьев Nicotiana hamana.

Активность Gus можно оценить визуально с помощью гистохимического окрашивания или количественно с помощью флуориметрического анализа. Основным преимуществом этой методики перед существующими методами, такими как анализ фрагментации ДНК (DNA laddering) или TUNEL-анализ, которые часто применяются в системах млекопитающих, но трудно воспроизводимы на растениях, является то, что данный экспресс-анализ на растительных системах обладает высокой чувствительностью и скоростью, основываясь на простом факте: для экспрессии gas необходимы живые клетки. Сегодня процедуру продемонстрирует Hua RAOs.

Для проведения инфильтрации постдоку-исследователю в нашей лаборатории потребуются полностью развернутые здоровые листья растений Nicotiana hamana в возрасте от трех до шести недель, выращенных при температуре 25 °C. Планируйте выполнение данного протокола в течение восьми дней. В первый день нанесите на чашки штрихами из глицериновых стоков Agrobacterium tumefaciens, содержащих векторы для анализа гибели клеток и вектор с экспрессионной кассетой Gus; также всегда включайте пустой вектор в качестве отрицательного контроля или «заполнителя», когда тестируется несколько комбинаций культур.

Инкубируйте планшеты при 28 °C в течение двух дней. На третий день инокулируйте 2 мл селективной среды LB отдельной колонией с каждого планшета. Инкубируйте каждую культуру при перемешивании при 28 °C в течение 24 часов при 200 об/мин до достижения максимальной плотности роста.

После 24 часов инкубации полностью ресуспензируйте культуру путем пипетирования, если наблюдается образование комков, и доведите общий объем каждой культуры до 10 миллилитров свежей селективной средой LB для индукции генов вирулентности agrobacterium. Добавьте ацетон до концентрации 25 micromolar и инкубируйте каждую культуру при перемешивании при 28 degrees Celsius еще в течение 16 часов. Следующим шагом является центрифугирование каждой культуры при 4,000 Gs в течение 10 минут при комнатной температуре и ресуспендирование осадка в 10 миллилитрах среды для инфильтрации.

Не добавляйте ацетон, повторно центрифугируйте культуры, а затем ресуспендируйте. Каждое осадочное pellet суспендируют в пяти миллилитрах среды для инфильтрации, содержащей 100 micromolar ацетона. Теперь измерьте OD при 600 nanometers.

Допустимы концентрации вплоть до 0.1, однако при значениях выше 0.9 необходимо развести пробу до 0.9 средой для инфильтрации и ацетоном перед началом инфильтрации. После инкубации повторно инкубируйте культуры при 28 °C с перемешиванием в течение трех часов. Смешайте экспериментальные и контрольные культуры в соотношении один к одному с культурой, содержащей кассету Gus.

Для каждой культуры используйте одномиллилитровый шприц без иглы для инфильтрации области запечатывания ABA или нижней стороны только что появившихся листьев. Объем инфильтрата не имеет принципиального значения. Когда сформируется область, пропитанная водой, это будет означать, что введено достаточное количество раствора; инфильтрируйте отрицательный контроль и исследуемый ген на противоположных листьях одного и того же растения, затем таким же образом обработайте еще два растения.

Таким образом, для каждой культуры предусмотрено по три повторности растений. Через три дня после инфильтрации наступает время сбора листьев и анализа экспрессии белка густина. Начните гистохимический анализ с вакуумной инфильтрации всего листа субстратом xlu до полного его пропитывания.

Теперь инкубируйте листья в темноте при комнатной температуре в течение ночи или до появления отчетливого синего окрашивания. Промойте листья дистиллированной водой и инкубируйте их в 70% ethanol в течение ночи до полного удаления хлорофилла. На следующий день промойте листья дистиллированной водой и оцените уровни экспрессии GUS.

Для количественного определения экспрессии Gus субстрат mug превращается в флуоресцентный продукт mu, который можно измерить. Начните с измельчения инфильтрированных дисков листьев в ступке с использованием жидкого азота. Затем добавьте 100 µL буфера для экстракции GUS, поддерживая образец на льду. После этого центрифугируйте суспензию при 14,000 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C и соберите супернатант, содержащий все растворимые белки, включая Gus.

Измерьте общую концентрацию растворимых белков с помощью NanoDrop и доведите концентрацию каждого образца в экстракционном буфере Gus до 100 µg общего белка. Затем добавьте к каждому образцу субстрат mug в экстракционном буфере Gus до конечной концентрации 2 mM mug. Общего объема 100 µL на образец должно быть достаточно; перемешайте содержимое путем пипетирования и инкубируйте реакционную смесь в течение одного часа при 37 °C.

Через час остановите реакцию, добавив 800 µL стоп-буфера для GUS. Для количественного определения GUS 100 µL каждого образца наносят на микротитрационный планшет, который анализируют на флуоресцентном планшетном ридере; измеряют длину волны возбуждения 365 nm и длину волны эмиссии 455 nm, затем сравнивают результаты со стандартной кривой. Активность GUS может быть выражена как количество единиц активности GUS на мкг общего растворимого белка в минуту реакции. Различные уровни экспрессии GUS обнаруживаются в зависимости от используемой конструкции, когда кассета экспрессии GUS совместно инокулируется с негативным регулятором гибели клеток или анти-апоптотическим геном.

При сравнении наблюдаются высокие уровни Gus. Уровни Gus в контроле с пустым вектором значительно ниже. И наоборот, при использовании позитивного регулятора клеточной гибели или про-апоптотического гена наблюдается заметное снижение экспрессии Gus по сравнению с контролем с пустым вектором.

После освоения выполнение данной методики занимает примерно одну неделю. При проведении этой процедуры важно помнить, что данный метод используется в качестве начального этапа для определения потенциала специфических генов. Для подтверждения этих предварительных результатов и определения типа вовлеченных клеток требуются дополнительные исследования.