Β-глюкуронидазы (GUS) Основываясь Анализ гибели клеток

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы использовать репортерную систему Гаса для анализа потенциальных смертоносных свойств конкретных генов. Гены, представляющие интерес, клонируют в кассету Gus и выращивают в соответствующих векторах агробактерий под 35-секундным промотором. Затем эти векторы преобразуются в штамм агробактерий, LBA 44 0 4, и смешиваются с культурой, содержащей кассету для экспрессии Gus, чтобы проникнуть в листья Nick Oceana Hamana.

Активность Гаса может быть оценена визуально с помощью гистохимического окрашивания или количественно с помощью флюорометрического анализа кружки. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как лестничный анализ ДНК или туннельный анализ, обычно используется в системах млекопитающих, но трудно воспроизводится в растениях, заключается в том, что это чувствительный, быстрый растительный переходный анализ, который использует тот простой факт, что для экспрессии газа необходимы живые клетки. Сегодня эту процедуру продемонстрируют РАО Хуа.

Научный сотрудник нашей лаборатории «Инфильтрация» требует полностью раскрытых здоровых листьев растений nicotiana hamana возрастом от трех до шести недель, выращенных при температуре 25 градусов по Цельсию. Планируйте выполнять этот протокол в течение восьми дней. В первый день полосы натирают глицериновыми запасами агробактерий fassan, содержащими векторы для анализа клеточной смерти, и вектор с кассетой для экспрессии Gus также всегда включают пустой вектор в качестве отрицательного контроля или наполнителя при тестировании нескольких комбинаций культур.

Инкубируйте пластины при температуре 28 градусов Цельсия в течение двух суток. На третий день внесите по два миллилитра селективного LB с одной колонией из каждой пластины. Инкубируйте каждую культуру, встряхивая при температуре 28 градусов Цельсия в течение 24 часов при 200 об/мин до достижения максимальной плотности роста.

После 24 часов инкубации полностью ресуспендировать культуру путем пипетирования, если есть комкование, и увеличить общий объем для каждой культуры до 10 миллилитров свежим селективным LB, чтобы индуцировать гены вирулентности агробактерий. Добавьте ацетон на 25 микромоляров и инкубируйте каждую культуру при встряхивании при температуре 28 градусов Цельсия еще 16 часов. Следующим этапом является центрифугирование каждой культуры при 4000 G в течение 10 минут при комнатной температуре и суспензия гранулы в 10 миллилитрах инфильтрационной среды.

Не добавляйте ацетон, центрифугируйте культуры еще раз, но теперь Резус. Суспензируйте каждую гранулу в пяти миллилитрах инфильтрационной среды, содержащей 100 микромолярных ацетонов. Теперь измерьте внешний диаметр на 600 нанометров.

Допустимы концентрации до 0,1, но если выше 0,9, то перед инфильтрацией разбавляют до 0,9 инфильтрацией, средой и ацетоном. Инкубируйте культуры еще раз при температуре 28 градусов Цельсия с встряхиванием в течение трех часов после инкубации. Смешайте экспериментальные и контрольные культуры в соотношении один к одному с культурой, содержащей кассету Gus.

Для каждой культуры используйте одномиллилитровый безыгольный шприц, чтобы проникнуть в уплотнение ABA или нижнюю часть недавно появившихся листьев. Объем инфильтрации не важен. Когда образуется достаточно места для впитывания воды, проникайте как отрицательный контроль, так и анализируемый ген на противоположных листьях того же растения, затем проникайте еще на два растения таким же образом.

Так что для каждой культуры существуют тройные растения. Через три дня после инфильтрации наступает время сбора листьев и анализа на экспрессию белка на порыве. Начните гистохимический анализ с вакуумной инфильтрации всего листа субстратом xlu до полного его пропитки.

Теперь инкубируйте листья в темноте при комнатной температуре в течение ночи или до тех пор, пока не появится отчетливое синее окрашивание. Промойте листья в дистиллированной воде и инкубируйте их в 70% этаноле в течение ночи, пока хлорофилл не будет удален. На следующий день промойте листья и дистиллированную воду и оцените уровень экспрессии GUS.

Чтобы количественно оценить экспрессию Gus, кружка с субстратом преобразуется в флуоресцентный продукт mu, который можно измерить, начав с измельчения инфильтрированных листовых дисков в ступке с использованием жидкого азота. Затем добавьте 100 микролитров буфера для экстракции ГАС, держа образец на льду. Теперь центрифугируйте суспензию при 14 000 GS в пять минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость, содержащую общее количество растворимых белков, в состав которых входит Gus.

Измерьте общую концентрацию растворимого белка с помощью NanoDrop и отрегулируйте концентрацию до 100 микрограммов общего белка для каждого образца в экстракционном буфере Gus. Теперь добавьте субстрат кружки в буфер для экстракции Гаса к каждому образцу до конечной концентрации двух миллимоляров. Общий объем в 100 микролитров на образец должен быть достаточным для смешивания пипетированием и инкубации реакции в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Через час остановите реакцию, добавив 800 микролитров буфера для остановки порывов. Для количественного определения mu 100 микролитров каждого образца загружают на планшет с микротитром, который анализируют в планшетном ридоресцентном считывателе флуоресценции при возбуждении 365 нанометров, измеряют длину волны излучения 455 нанометров, и сравнивают со стандартной кривой, активность Guss затем может быть представлена как M of mu на микрограмм общего растворимого белка в минутной реакции. Различные уровни порывов детектируются в зависимости от конструкции, используемой при инфильтрации кассеты экспрессии GUS с негативным регулятором клеточной смерти или геном, препятствующим смерти.

При сравнении наблюдаются высокие уровни порывов. Уровни Гаса в пустом векторе намного ниже. И наоборот, когда используется положительный регулятор клеточной смерти или ген, способствующий смерти, наблюдается снижение экспрессии Gus на рынке по сравнению с контролем пустого вектора.

После освоения этой техники ее можно освоить примерно за одну неделю. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что эта техника используется в качестве начального шага для определения потенциала конкретных генов. Необходимо провести дополнительную работу, чтобы подтвердить эти первоначальные результаты и определить тип вовлеченной клетки.