Изображений гликанов в данио рерио Эмбрионы от метаболического Маркировка и Bioorthogonal химии нажмите

Недавняя демонстрация визуализации гликанов in vivo использует биоортогональную химическую репортерную стратегию обработки клеток или организмов моносахаридами, меченными алкином или азидами. Модифицированные моносахариды, обработанные механизмом биосинтеза гликанов, включаются в гликоконъюгаты клеточной поверхности, биоортогональные алкины или азидные метки. Затем позвольте ковалентную конъюгацию с помощью флуоресцентных зондов для визуализации или с аффинными зондами для обогащения и гликопротеомного анализа.

Этот метод, основанный на клик-химии, позволяет быстро, неинвазивно и надежно обнаруживать гликаны алкина или ази в эмбрионах рыбок данио-рерио и может быть легко расширен для визуализации других классов гликанов в развивающихся организмах. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как лектин или методы обнаружения гликанов на основе антител, заключается в том, что он может быть применен к динамической визуализации in vivo. Лектины и методы визуализации на основе антител обеспечивают только моментальный снимок гликанов в определенный момент времени.

Их сложно реализовать в контексте динамических исследований. Кроме того, мечение гликанов лектинами или антителами требует удаления интересующих клеток или тканей из их естественной среды и их фиксации перед анализом. Напротив, мечение гликанов с использованием биортогональной стратегии химического репортера преодолевает эти ограничения и может быть непосредственно применено к неинвазивной визуализации гликанов в живых системах, таких как эмбрионы рыбок данио и эмбрионы морской элегантности.

С помощью BTT Es Azi Aine Cyclo edition, биосовместимой версии химического состава Qlik, надежная маркировка может быть достигнута в течение одной-пяти минут. Вещи для обработки процедуры будут данные как из моей лаборатории, так и из моей лаборатории, собирать и переносить икру данио в 35-миллиметровую чашку Петри. Удалите как можно больше воды, а затем добавьте один миллиграмм на миллилитр, проназу Е в зародыше среды, чтобы корион переварил через три-пять минут, когда может произойти пузыри кориона, слить блюдо в стакан, наполненный водой для рыбы.

Аккуратно переложите яйца в стакан, дав им упасть в воду. Тщательно промойте икру рыбьей водой так, чтобы большая часть икры высвободилась из кориона. Теперь с помощью отполированной на огне пипетки переложите покрытые оболочкой яйца в покрытые агросом чашки Петри, заполненные Е тремя эмбриональными средами Заполните подготовленные инъекционные формы Е тремя эмбриональными средами и переложите в покрытые оболочкой яйца.

Затем приготовьте иглу и загрузите два микролитра раствора для инъекций, содержащего 20 миллимоляров GDP Fuk all и либо 5%lor, 5 94 декстрина в качестве индикатора, либо 0,1% фенилкрасного красителя в 0,2 моляра хлорида калия в качестве отрицательного контроля. Замените GDP FUCA на GDP Fuco в растворе для инъекций. Теперь сломайте иглу и отрегулируйте давление инъекции и продолжительность впрыски на одну нанолитровую каплю.

Затем введите в яйца один нанолитр раствора. Наконец, переложите введенные яйца в покрытые агросом чашки Петри, заполненные E тремя эмбриональными средами, и инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение трех-четырех часов после оплодотворения. Удалите неоплодотворенные яйца, когда эмбрионы достигнут желаемых стадий развития, таких как поздняя сегментация тканей газо и ранняя личинка.

Покройте основание пластины на 96 лунок с помощью арос. Добавьте 92 микролитра зародышевой среды в каждую лунку с последующим добавлением четырех микролитров ofor 4 88 азида из запаса 2,5 миллимоляра в воду и двух микролитров B-T-T-E-S медного купороса шесть к одному комплексу с помощью дозатора из полированного стекла. Перенесите в лунку менее пяти эмбрионов.

Продолжая клик-химию реактив добавить 2,5 микролитра свежеприготовленного 100 ммолярного аскорбата натрия. Чтобы инициировать реакцию клика, реагируйте в течение трех минут. Теперь добавьте два микролитра 50 миллимоларного бато сульфоната вина Купера, биосовместимого медного хелатора для гашения реакции и сразу же разбавьте 100 микролитрами зародышевой среды.

Переложите эмбрионы в стеклянную чашку Петри и промойте обработанные эмбрионы два раза 15 миллилитрами зародыша. Терпимая. Поместите каплю со сверхнизкой температурой плавления на чашку для микролунок с матовым стеклянным дном и перенесите зародыш в каплю aros. Поместите эмбрион и поставьте блюдо на лед на пять минут.

Чтобы капля агро застыла, аккуратно добавьте зародыш среды в блюдо, пока оно не покроет агрос. Капайте последовательно. Получайте флуоресцентные и светлопольные изображения с помощью конфокального микроскопа с шагом в пять микрон и стройте составные фигуры.

С помощью изображения. J-B-T-T-E-S - это лиганд на основе атриаминов, который значительно ускоряет медь a c при координации с NC двумя генерируемыми медью и способствует быстрой реакции циклического издания в живых системах без видимой токсичности. Здесь эмбрионы рыбок данио маркируются с помощью меди, опосредованной B-T-T-E-S.

A a C через 9,5 часов после оплодотворения сразу после трехминутной реакции щелчка. Надежная маркировка GDPF для всех обработанных эмбрионов обнаруживается в соответствии с ожиданиями. Для контрольных эмбрионов обнаруживается только фоновая флуоресценция: микроинъекции с помощью GDP Fuco, мечение и визуализация могут быть выполнены в любое время между 2,5 и 96 часами после оплодотворения.

Эти изображения получаются через 24 и 48 часов после оплодотворения. Погоня за пульсом. Использование этой стратегии позволяет осуществлять мониторинг динамического биосинтеза насыщенных гликанов, при которых Alcon fuco, произведенные в разные моменты времени, мечаются флуорофорами разных цветов.

Эта процедура может быть объединена с генетическими мутантами или методами генетического подавления, основанными на морфах, чтобы проанализировать специфическую роль отдельных ферментов, синтезирующих гликан, у рыбок данио. Эмбриогенез. Тем не менее, этот метод может дать представление о биосинтезе глико. Он также может быть применен к другим посттрансляционным модификациям, таким как ацилирование при ликвидации.

Он также может быть применен для изучения вновь синтезированных белков.