Определение концентрации нуклеиновых кислот и белков Использование Micro объемом Био-спецификации Nano Спектрофотометр
17 февраля 2011 г.
Данное сообщение представляет данные о точности и воспроизводимости BioSpec-нано UV-VIS спектрофотометр для двухцепочечной ДНК и белков количественного определения. Даже с ультра-малых объемов (от 1 до 2 л), воспроизводимость отлично, в то время как автоматизированные вытирая функция повышает пропускную способность и приводит к минимальным переносом на более точные результаты.
Общая цель данной процедуры заключается в точном и воспроизводимом определении концентрации нуклеиновых кислот и белков с помощью микрообъемного спектрофотометра. Для этого сначала выбирается соответствующая длина оптического пути для измеряемого образца. Вторым этапом процедуры является измерение холостой пробы.
Затем измеряют образец ДНК или белка. Заключительным этапом процедуры является сохранение данных в формате PDF или CSV. В итоге получаются высоковоспроизводимые результаты для ДНК и белков.
С помощью данного метода можно быстро и точно провести количественное определение. Основными преимуществами этой методики являются скорость, точность и воспроизводимость. Чтобы приступить к процедуре количественного определения ДНК, включите спектрофотометр BIOS spec nano.
Откройте программное обеспечение BIOS spec nano с рабочего стола ПК. Перейдите на вкладку simple nucleic acid D-S-D-N-A. Программа установит связь с прибором и запустит последовательность инициализации.
Это подтверждает, что прибор работает в соответствии с техническими характеристиками. Далее выберите длину оптического пути с помощью ползунка выбора длины пути.
Для образцов с микролитровым объемом доступно три варианта. Можно использовать кюветы с длиной оптического пути 0,2 мм или 0,7 мм. А для разбавленных образцов предусмотрен вариант использования кюветы с длиной оптического пути 5 мм.
В данной демонстрации для измерения пробы объемом 2 µL выбран путь луча 0,7 мм. Все расчеты основаны на выбранной длине пути. Далее в программном обеспечении перейдите на вкладку «Setup» и выберите «Auto Wiping Setup».
Выберите один вариант для одного протирания. Перед измерением образца или каждый раз при выборе новой длины оптического пути необходимо выполнить измерение холостой пробы. При длине оптического пути 0.7 millimeter нанесите пипеткой 2 µL воды или буфера на пьедестал. Нажмите «blank» для проведения измерения холостой пробы.
Верхнее окно переместится для контакта с каплей образца, после чего будут видны вспышки ксенона. По завершении измерения скребок автоматически удалит образец. Теперь можно приступить к измерению образца.
Важно использовать гомогенный раствор образца, так как наличие нерастворенных твердых частиц приведет к невоспроизводимости данных. Чтобы избежать появления пузырьков воздуха, осторожно аспирируйте 2 µL образца, а затем равномерно нанесите его из наконечника пипетки на пьедестал.
Нажмите кнопку запуска на приборе. Как и ранее, верхнее окно переместится для установления контакта с каплей образца; при этом будут наблюдаться вспышки ксенона. Для определения воспроизводимости повторите измерение одного и того же образца трижды. Все записанные данные автоматически сохраняются в виде файла A BUD. Чтобы сохранить данные в формате PDF или CCSV, нажмите «save P-D-F-C-S-V».
Результаты также можно сохранить в формате CSV-файла, выбрав соответствующий вариант на вкладке сохранения. Количественное определение белка может быть выполнено методом поглощения при 280 нм. Для количественного определения белка выберите вкладку определения белка.
Введите коэффициент экстинкции epsilon 280, если он известен; если Epsilon 280 неизвестен, рассчитайте его с помощью функции Epsilon 280 calc. Для измерения образца объемом 3 µL с помощью ползунка длины оптического пути выберите 0,2 мм. Затем в программном обеспечении перейдите на вкладку setup и выберите auto wiping setup. Выберите значение 2 для выполнения двух циклов протирки, чтобы предотвратить перенос образца и обеспечить точность показаний.
Для калибровки по бланку нанесите три µL воды или буфера на пьедестал, затем нажмите «blank» для измерения холостой пробы. Далее осторожно нанесите три µL образца белка на пьедестал. Чтобы начать измерение образца, не допуская появления пузырьков воздуха, нажмите «start» в программном обеспечении или кнопку «start» на приборе.
Повторите измерение одного и того же образца трижды, чтобы определить показанную воспроизводимость. Ниже приведены данные измерений типичного образца двухцепочечной ДНК. Формула, используемая для расчета концентрации ДНК: концентрация образца равна DF, умноженному на (OD 260 минус OD 320), умноженному на NACF, где DF — коэффициент разведения образца, а NACF — коэффициент концентрации нуклеиновой кислоты.
Коэффициент концентрации нуклеиновой кислоты устанавливается в соответствии с выбранным аналитом. Указываются расчетная концентрация нуклеиновой кислоты и соотношение OD 260/280. В данной таблице приведены результаты проверки воспроизводимости количественного определения ДНК.
В совокупности полученные данные демонстрируют высокую воспроизводимость результатов, о чем свидетельствует низкое относительное стандартное отклонение, составляющее 0.26%. Здесь представлены репрезентативные результаты анализа концентрации белка BSA. Концентрация белка в мкг/мл рассчитана на основе значения Epsilon 280. Наконец, в данной таблице приведен анализ воспроизводимости количественного определения белка.
Относительное стандартное отклонение 0,51% указывает на то, что BIOS spec nano точно измеряет оптическую плотность не только для ДНК, но и для белков. После освоения методики анализ нескольких образцов может быть проведен за одну минуту.
Обзор
В данном исследовании оценивается точность и воспроизводимость спектрофотометра BioSpec-nano UV-VIS при количественном определении двухцепочечной ДНК (дцДНК) и белков. Метод демонстрирует отличную воспроизводимость даже при использовании сверхмалых объемов образцов, что позволяет увеличить пропускную способность при минимальном переносе образца.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Аналитическая химия
- Биотехнология
Теоретические основы
- Точное количественное определение нуклеиновых кислот и белков имеет решающее значение в биологических исследованиях.
- Микрообъемная спектрофотометрия позволяет проводить анализ с минимальными требованиями к объему образца.
- Автоматизированные функции могут повысить эффективность и точность измерений.
- Воспроизводимость необходима для получения надежных результатов экспериментов.
Цель исследования
- Оценить эффективность спектрофотометра BioSpec-nano для количественного определения нуклеиновых кислот и белков.
- Разработать протокол для проведения точных измерений при использовании малых объемов образцов.
- Продемонстрировать достоверность результатов с помощью повторных измерений.
Используемые методы
- Выбор подходящей длины оптического пути для измерения образца.
- Измерение холостой пробы перед анализом образца.
- Автоматическое протирание для предотвращения перекрестного загрязнения между образцами.
- Сохранение данных в форматах PDF или CSV для дальнейшего анализа.
Основные результаты
- Высоко воспроизводимые результаты количественного определения ДНК с относительным стандартным отклонением 0,26%.
- Количественное определение белков также продемонстрировало высокую точность с относительным стандартным отклонением 0,51%.
- С помощью BioSpec-nano можно проводить быстрые и точные измерения.
- Возможность быстрого анализа нескольких образцов позволяет увеличить пропускную способность.
Выводы
- Спектрофотометр BioSpec-nano обеспечивает надежное количественное определение как двухцепочечной ДНК (dsDNA), так и белков.
- Автоматизированные функции значительно повышают эффективность измерений.
- Данный метод подходит для высокопроизводительных приложений в биологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное и воспроизводимое количественное определение нуклеиновых кислот и белков имеет важное значение для валидации мишеней и разработки анализов на ранних этапах поиска новых лекарственных средств. Микрообъемный спектрофотометр BioSpec-nano обеспечивает высокопроизводительные измерения с низким расходом образца и автоматизированной обработкой проб, что снижает вариабельность и повышает достоверность данных в рабочих процессах идентификации ведущих соединений. Быстрый цикл измерения и низкое относительное стандартное отклонение обеспечивают прогностическую уверенность в последующем скрининге и трансляционных исследованиях.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Обеспечивает точный количественный анализ образцов нуклеиновых кислот и белков для поддержки анализа экспрессии мишеней и исследования сигнальных путей.
- Практическая ценность: Снижает расход образцов и количество этапов ручной обработки, что увеличивает пропускную способность при проверке гипотез в поисковых биологических исследованиях.
- Прогностическая ценность: Низкое относительное стандартное отклонение (0,26% для DNA, 0,51% для белков) повышает достоверность количественных данных, используемых для принятия решений о целесообразности дальнейшего проведения исследований.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает воспроизводимые измерения абсорбции (OD260-OD320 для ДНК, OD280 для белка), подходящие для стандартизации анализа и квалификации реагентов.
- Эксплуатационная ценность: Автоматизированное протирание и обнуление минимизируют перенос образцов и обеспечивают согласованность измерений между планшетами или партиями.
- Масштабируемость: Трехсекундное время измерения позволяет проводить экспресс-скрининг библиотек образцов или результатов фракционирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает количественное определение биомаркеров и анализ фармакокинетических проб в случаях, когда требуется высокоточное детектирование малых объемов.
- Механистическое снижение рисков: точные данные о концентрации белка (рассчитанные через ε280 по остаткам Trp, Tyr и Cys-S-S) позволяют правильно подобрать дозировку для функциональных анализов.
- Интеграция рабочих процессов: вывод данных в форматах PDF/CSV облегчает отслеживание информации и кросс-функциональный обмен данными между группами по поиску новых лекарственных средств и доклиническими командами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Система BioSpec-nano встраивается в общую цепочку исследований: от первичной валидации мишени и разработки анализа до доклинического анализа образцов, что особенно важно в случаях, когда критическое значение имеют экономия материала и воспроизводимость измерений.
- Биологические исследования: обеспечивает количественное определение нуклеиновых кислот (например, конструкций экспрессии генов) и белков (например, очищенных мишеней, антител) для подтверждения мишеней на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: позволяет осуществлять контроль качества исходных образцов и результатов реакций в биохимических или клеточных анализах с минимальными требованиями к объему.
- Аналитика: обеспечивает количественные результаты на основе оптической плотности с автоматической коррекцией длины оптического пути и расчетом коэффициента экстинкции для белков.
- Трансляционные исследования: совместим с доклиническими образцами малого объема (например, плазмой, лизатами тканей), требующими точной нормализации концентрации.
- Корпоративное использование: функционирует как общий ресурс базовой лаборатории для стандартизированного количественного анализа в рамках нескольких проектов и методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает качество и воспроизводимость данных при количественном определении нуклеиновых кислот и белков, снижая количество ложноотрицательных и ложноположительных результатов при первичном скрининге.
- Операционная ценность: Автоматизация подачи образцов, измерения и очистки снижает влияние человеческого фактора и повышает эффективность работы лаборатории.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более быстрый цикл итераций при оптимизации соединений-лидеров за счет предоставления надежных количественных данных для исследований зависимости «структура — активность» (SAR).
- Влияние на портфель: Поддерживает распределение ресурсов с учетом рисков, предоставляя достоверные количественные данные для приоритизации мишеней.
Особенности реализации
- Требуется знание принципов работы спектрофотометра и подбора длины оптического пути в зависимости от концентрации образца.
- Необходим доступ к ПК с установленным программным обеспечением BioSpec-nano и регулярное обслуживание оптических поверхностей.
- Рекомендуется использование стандартизированных СОП по обнулению, протирке и нанесению образцов для обеспечения согласованности результатов при работе разных пользователей.
- Возможность адаптации под различные типы образцов (ДНК, белки, другие аналиты) с помощью настройки программного обеспечения и регулировки длины оптического пути.
- Ограничено количественным определением на основе абсорбции; не подходит для флуоресцентного или люминесцентного анализа без дополнительного оборудования.
