Поляризованные транслокации флуоресцентных белков в Xenopus Эктодермы в ответ на Wnt сигнализации

Общая цель данной процедуры заключается в изучении изменений субклеточной локализации белков при передаче сигналов факторов роста. Это достигается путем первоначального инъецирования в бластомеры животных полюсов ранних эмбрионов xenopus РНК, кодирующих RFP и сигнальный рецептор FRIZZLED eight. Затем подготавливаются электродермальные имплантаты и/или криосрезы эмбрионов с последующим иммуноокрашиванием.

Наконец, клетки, окрашенные иммуногистохимическим методом, визуализируют с помощью флуоресцентного микроскопа. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие, как субклеточная локализация специфического белка зависит от сигнальных путей эмбрионального развития. В качестве примера мы показываем, что белок diverse перемещается из центросомы к клеточной мембране под воздействием рецептора FRIZZLED eight.

Данный метод позволяет исследователям визуализировать субклеточную локализацию сигнальных белков in vivo с использованием эмбрионов xenopus. Это может помочь в решении фундаментальных вопросов биологии развития и клеточной биологии, таких как изучение пространственной регуляции сигналинга и механизмов клеточного приоритета. Для начала процесса оплодотворения in vitro получите икринки от самок лягушек, которым был введен хорионический гонадотропин человека.

За 12 часов до начала эксперимента добавьте от 0,5 до 1 мл 1X модифицированного раствора Рингера Маркса (MMR) к икре и проведите оплодотворение in vitro, добавив небольшой фрагмент препарированного семенника. Через две-три минуты снизьте концентрацию солей, добавив 0,1X MMR для активации подвижности сперматозоидов. Инкубируйте в течение 20 минут.

После оплодотворения яйцеклетки ориентируются анимальным полюсом вверх. Удалите желеобразную оболочку яйца, заменив раствор MMR 3% раствором цистеина в воде на пять минут. Промойте яйцеклетки трижды раствором 0.1 XMMR.

Инкубируйте при 13 °C до стадии двух–четырех клеток. Затем перенесите эмбрионы в 3% фикаль в 0,5 XMMR для микроинъекций.

Синтезируйте РНК из линеаризованных матриц ДНК с использованием набора M message M machine и разведите в воде, свободной от РНКаз, до концентрации от 0,1 до 1 мкг/мкл. РНК для диверсификации RFP, маркера мембраны GFP CX и FRIZZLED 8 используют в количестве от 0,1 до 1 нг на одну инъекцию. Перед инъекцией из капиллярных трубок с помощью пуллера и шлифовального устройства для игл подготовьте инъекционные иглы.

Откалибруйте каждую иглу с помощью воды, чтобы за одну инъекцию вводилось 10 литров жидкости. Поместите эмбрионы на пластиковую чашку в большую каплю 3%fial 0.5 XMMR. Наберите один микролитр раствора РНК в инъекционную иглу с помощью узкого микроинъектора shige.

Инъецируйте 10 nanoliters РНК в каждый из двух бластомеров двухклеточных эмбрионов. Перенесите инъецированные эмбрионы в лунку 12-луночного планшета и инкубируйте при 13 °C до достижения ими ранней стадии гаструляции.

Перенесите эмбрионы на стадии гаструляции в раствор 0,6 XMMR в пластиковую чашку диаметром шесть сантиметров, покрытую 1% aeros. Вручную удалите вителлярную мембрану с помощью пинцета. Затем с помощью иглы tsin и волосяной петли вырежьте эктодермальные эксплантаты из эмбрионов.

Фиксируйте их в 3,7% формальдегиде в PBS в течение 30 минут. Промойте X explan трижды по 10 минут в PBS. Для окрашивания ядер добавьте davi к третьей промывке.

Затем закрепите эксплантат X на предметном стекле, поместив его между двумя полосками прозрачной клейкой ленты так, чтобы внутренняя непигментированная сторона эксплантата X была обращена к объективу. Добавьте две-три капли фиксирующего раствора по 20 µL. Сверху накройте покровным стеклом.

Инъецированные эмбрионы можно подвергнуть криосекционированию для визуализации распределения флуоресцентных белков в клетке и проведения ко-окрашивания специфическими антителами. На 10-й стадии зафиксируйте эмбрионы в течение одного-двух часов при комнатной температуре с использованием плотного фиксатора в стеклянном флаконе объемом 4 мл. Затем, после промывки в PBS, заключайте эмбрионы в раствор из 15% рыбного желатина и 15% сахарозы в том же флаконе.

На следующий день перенесите эмбрионы в пластиковую форму. Быстро заморозьте их на сухом льду. Затем с помощью криостата подготовьте криосрезы.

Выполните иммунофлуоресцентное окрашивание срезов, зафиксируйте препараты и проведите визуализацию эмбрионов в поперечном сечении, используя тот же метод, который был описан для имплантатов эктодермы. Получите изображения с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio plan с соответствующими фильтрами и программным обеспечением для идентификации и визуализации специфических Z-плоскостей в пределах X-плоскости. На данном рисунке ersin локализован в центросоме клеток эктодермы, но транслоцирован к клеточной мембране.

В ответ на Frizzled eight, cex GFP маркирует клеточную мембрану зеленым цветом. Diverse in RFP окрашен в красный, а ядра, маркированные DPI, — в синий. На криосрезах эмбриона Frizzled eight рекрутирует Diverse in RFP к клеточной мембране.

Гамма-тубулин является маркером центросомы. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о полезности эмбрионов XUS и эмбриональных клеток для изучения процессов белкового докинга и сигналинга с субклеточным разрешением.