Определение Митохондриальная мембранного потенциала и активных форм кислорода в Живом Крыса корковых нейронов

Целью данной процедуры является определение потенциала митохондриальной мембраны и уровней активных форм кислорода в первичных корковых нейронах с помощью флуоресцентных зондов, TMRM и H 2D CFD соответственно. Это достигается путем предварительной подготовки исходных и рабочих концентраций TMRM и H 2D CFDA. Вторым шагом является инкубация корковых нейронов с TMRM и H 2D CFDA при комнатной температуре в течение 45 минут в буфере для тайских дорог.

Третий шаг заключается в изображении интенсивности флуоресценции TMRM и DCF в живых корковых нейронах с использованием излучения возбуждения 5, 15, 5, 17 нанометров и 4, 88, 5, 15 нанометров, соответственно. Изменения TMR во флуоресценции будут контролироваться в присутствии митохондриального unco FCCP, в то время как изменения флуоресценции DCF будут контролироваться в присутствии перекиси водорода. Заключительным этапом этой процедуры является сбор, нормализация и анализ данных.

В конечном счете, результаты получены путем построения графика, который показывает относительные уровни интенсивности флуоресценции TMRM и DCF до и после обработки FCCP и перекисью водорода соответственно. Здравствуйте, меня зовут Джоанна Коска. Добро пожаловать в мою лабораторию в Университете Лойолы в Чикаго.

Сегодня мы покажем вам, как измерить потенциал митохондриальных мембран и активные формы кислорода в нейронах коры головного мозга крыс. Процедура будет продемонстрирована с помощью dhi. Привет, я де Дениз Джосси.

С помощью этой процедуры можно измерить потенциал митохондриальной мембраны по одной митохондриальной метке и активных форм кислорода по одной клеточной метке. Итак, приступим. Приготовьте 10 миллимолярный запас TMRM, растворив пять миллиграммов TMRM в одном миллилитре безводного вихря оксида диметилсульфа в течение одной минуты.

Затем сделайте аликвоты храните при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Беречь от света и использовать в течение одного месяца. Затем приготовьте 10 миллимолярный запас H 2D CFDA, растворив 4,87 миллиграмма H 2D CFDA в одном миллилитре безводного оксида диметилсульфа.

Аналогично поворачиваем в течение одной минуты, затем делаем аликвоты и храним их при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Защитите от света и используйте в течение одной недели для загрузки корковых нейронов крыс TMRM. Трижды промойте культивируемые нейроны тиро-буфером.

Затем приготовьте 20 наномолярный TMRM, разбавив 10 миллимолярный запас TMRM в 1000 раз в столовой ложке. Затем добавьте два микролитра разведенного ТМРМ на один миллилитр ст. Инкубируйте нейроны с TMRM в течение 45 минут в темноте при комнатной температуре.

Через 45 минут установите чашку для культивирования на столик микроскопа и начните визуализацию для загрузки корковых нейронов крысы H 2D CFDA, трижды промойте культивируемые нейроны с помощью tb. Затем приготовьте два микромоляра H 2D CFDA, разбавив 10 мл запаса H 2D CFDA в 10 раз в столовой кладке. А затем добавить два микролитра разведенного H 2D CFDA на один миллилитр тб.

Затем инкубируйте нейроны с H 2D CFDA в течение 45 минут в темноте при комнатной температуре через 45 минут. Четырехкратная промывка нейронов ТБ для удаления избытка флуоресцентного индикатора перед получением изображений для выполнения живой визуализации нейронов, инкубированных с помощью ТМРМ, используется конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с применением программы живых временных рядов. Применяйте низкое разрешение и ослабленную мощность лазера, чтобы свести к минимуму время, необходимое для получения изображений, и избежать обесцвечивания фотографий.

Затем отрегулируйте фокус смонтированных нейронов, загруженных TMRM, с помощью отраженного света. Исследуйте флуоресценцию TMRM с помощью освещения на пяти 14 нанометрах и обнаружения на пяти 70 нанометрах. Установите коэффициент усиления обнаружения камеры чуть ниже уровня насыщенности после того, как будут установлены все параметры, которые включают разрешение, определение мощности лазера, усиление камеры и интервал интервальной съемки для получения изображений.

Не изменяйте эти настройки между экспериментами. Далее измените поле. Начните сбор изображений, чтобы проверить изменения дельта-PSY М-стимула, такие как один микромоляр FCCP или два микрограмма на миллилитр олигомицина, которые значительно деполяризуют или гиперполяризуют потенциал митохондриальной мембраны соответственно.

Эти изменения будут отражаться в снижении интенсивности флуоресценции TMRM по сравнению с исходной интенсивностью флуоресценции в случае FCCP или в увеличении интенсивности флуоресценции TMRM. В случае LIGA myin sin для выполнения визуализации нейронов в реальном времени инкубируется с помощью H 2D CFDA, сначала устанавливают культуральную чашку на предметный столик микроскопа, регулируют фокус клеток с помощью отраженного света. Исследуйте флуоресценцию DCF с помощью возбуждения на 4 88 нанометрах и излучения на пяти 15 нанометрах.

Затем отрегулируйте мощность лазера от пяти до 7%, определите усиление и разрешение 2 56 на 2 56. Не изменяйте эти настройки между экспериментами. Затем задайте периодичность получения живых изображений.

С помощью программы «Временные ряды» выберите новое поле и начните получение изображений для обнаружения изменений уровней Ros. Обрабатывайте клетки от 100 до 200 микромоляров перекиси водорода. Это будет отражено в увеличении интенсивности флуоресценции DCF по сравнению с исходным уровнем.

Используйте инструмент Область интереса из программы LSM для выбора областей. Затем выберите ROI из митохондриальных областей или ROI из всего тела клетки изображения. Для измерения интенсивностей флуоресценции TMRM или ROS соответственно.

Выделите регионы рядом с ячейками. Чтобы рассчитать интенсивность фоновой флуоресценции, выполните несколько измерений, а чтобы вычислить среднюю интенсивность фона, вычтите среднюю интенсивность фоновой флуоресценции из средней интенсивности флуоресценции областей интереса в каждой ячейке для каждой точки времени с помощью Microsoft Excel. После вычитания интенсивности фона нормализуйте интенсивность флуоресценции TMRM или DCF до исходной флуоресценции.

Используя эту формулу, затем используйте программу построения графика Sigma для создания графика, показывающего изменения интенсивности флуоресценции с течением времени. Вот пример флуоресцентного изображения нейронов коры головного мозга крысы, инкубированных с помощью TMRM. Добавление F-C-C-P-A митохондриального unco приводит к митохондриальной деполяризации и потере интенсивности флуоресценции TMRM.

Исходный уровень флуоресценции TMRM остается стабильным до добавления FCCP. Количественный анализ изменений флуоресценции TMRM с течением времени показывает значительное снижение флуоресценции TMRM после добавления FCCP. Вот пример флуоресцентного изображения нейронов коры головного мозга крысы, загруженных DCF.

Исходный уровень флуоресценции DCF остается неизменным в течение первых 120 секунд перед применением перекиси водорода. Добавление перекиси водорода приводит к увеличению интенсивности флуоресценции DCF в телах клеток. Покадровые измерения флуоресценции DCF показывают ее устойчивые уровни, которые увеличиваются после обработки перекисью водорода.

В этой процедуре важно помнить об использовании низкой мощности лазера и высокой скорости сканирования, чтобы избежать артефактов от фотообесцвечивания и фототоксичности. Удачи в эксперименте.