Система для культивирования Ирис пигмента эпителиальных клеток по изучению регенерации линз в Ньют

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании пигментированных эпителиальных клеток радужки для изучения регенерации хрусталика у тритона. Для этого сначала тритона анестезируют с помощью снотворного раствора, после чего проводят удаление глаз.

Вторым этапом процедуры является выделение пигментированных эпителиальных клеток радужной оболочки из тканей глаза, что начинается с удаления тканей сетчатки с последующим разрезанием фрагментов роговицы и радужки на дорсальную и вентральную половины. Затем клетки радужки отделяют от стромы и культивируют in vitro в течение двух недель. После двух недель культивирования клетки IPE агрегируют и имплантируют реципиенту, который был предварительно оптимизирован.

Спустя месяц заживления гистологический анализ выявляет потенциал регенерации хрусталика у клеток дорсальной и вентральной IPE. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение на этапах культивирования клеток и имплантации, которые трудно освоить, так как они требуют владения множеством навыков микродиссекции и хирургического вмешательства. Начните с анестезии по крайней мере семи голых мышей с использованием 0.1% этил-3-аминобензоат метанасульфоновой кислоты; хирургическим путем удалите глаза, используя пинцет и хирургические ножницы, отсекая веко вместе с конъюнктивой. Затем перережьте зрительный нерв.

Теперь быстро перенесите препарированные глаза в вытяжной шкаф и стерилизуйте их в этаноле Луго в течение трех секунд. Затем дважды промойте глаза раствором Хэнкса без кальция и магния. Перенесите их в свежий раствор Хэнкса и приступайте к препарированию.

С помощью скальпеля сделайте разрез в области глаза. Затем ножницами вырежьте ткани вокруг края роговицы. Удалите хрусталик и срежьте оставшуюся ткань сетчатки вместе со склерой.

Перенесите комплексы из радужки и роговицы в чашку со свежим раствором Хэнкса, используя скальпель № 15. Разделите комплексы на дорсальную и вентральную половины. Дорсальную и вентральную радужки идентифицируют по наличию черных пятен на склере с дорсальной стороны и V-образному разрезу на вентральной радужке.

Отделите вентральную часть радужки от дорсальной. Соберите фрагменты радужки в чашку диаметром 35 мм, содержащую 1 мл раствора L 15. Храните дорсальную и вентральную половины в разных чашках.

Теперь добавьте в лунки 150 µL раствора Dispa и инкубируйте их в течение двух часов при 27 °C. Для сбора клеток IPE из стромы с помощью пинцета осторожно отделите клетки IPE от всех собранных фрагментов ткани.

Затем перенесите клетки IPE в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 1000 RPM в течение двух минут при комнатной температуре, после чего удалите супернатант. Ресуспендируйте осадок в одном миллилитре раствора Хэнкса и повторите центрифугирование для отделения клеток. Удалите раствор Хэнкса и снова ресуспендируйте осадок.

В одном миллилитре раствора трипсина в разведении 1:250 инкубируйте клетки в течение двух часов при 27 °C. Для промывки клеток центрифугируйте суспензию и удалите трипсин. Добавьте один миллилитр раствора L 15 и снова центрифугируйте; повторите промывку еще раз, замените среду на 800 µL свежего раствора L 15 и осторожно ресуспендируйте клетки с помощью пипетки. Затем высейте клетки в 24-луночные планшеты, покрытые коллагеном.

Обычный выход с семи N составляет четыре лунки с дорсальными клетками и четыре лунки с вентральными клетками. Инкубируйте чашку в течение двух недель при 27 °C по истечении двух недель. Как показано здесь, IPE можно трансфецировать генами для изучения их функции при регенерации хрусталика.

Эта двухнедельная культура вентральных клеток ПЭР демонстрирует такую же морфологию, как и дорсальные клетки. Обратите внимание, что пигментация сохраняется на этой стадии как в дорсальных, так и в вентральных клетках радужки. Перед имплантацией клеток ПЭР их необходимо агрегировать, добавив к клеткам 20 µL красителя в 400 µL свежей культуральной среды, осторожно перемешать содержимое планшета круговыми движениями и оставить клетки в инкубаторе при 27 °C на ночь.

На следующий день осторожно пропипетируйте суспензию, чтобы отделить клетки, а затем перенесите их в пробирки объемом 1.5 мл. Теперь промойте клетки путем центрифугирования пробирок и замены супернатанта на 1 мл среды L 15. Повторите этот шаг дважды. Используйте 10 µL клеточной суспензии для подсчета количества клеток стандартными методами.

После проведения расчетов подготовьте от 3000 до 5 000 клеток в 200 µL среды L 15 на один агрегат. Затем центрифугируйте клетки и инкубируйте их в течение 48 часов. После этого клетки при температуре 27 °C можно имплантировать в животное-реципиент.

Начните с анестезии взрослой особи в сонолизе, пока она не перестанет двигаться. Затем с помощью лезвия скальпеля сделайте разрез в роговице глаза. После этого с помощью пинцета удалите хрусталик.

После удаления хрусталика поместите агрегат клеток IPE непосредственно под роговичную ткань на вентральной стороне глаза. Затем перенесите тритона в отдельный контейнер и дайте ране зажить. В этот период обращайтесь с животным осторожно, чтобы не повредить заживающую ткань.

Трансплантированным клеткам требуется один месяц для регенерации в новый хрусталик. По истечении месяца извлеките новые глаза с имплантированными агрегатами клеток и зафиксируйте ткань. Согласно стандартному протоколу дегидратации, фиксированную ткань заливают в формы для включения, подходящие для нарезания срезов толщиной 15 микрометров, которые затем окрашивают соответствующим образом.

После имплантации агрегата в глаз, не имеющий хрусталика, агрегат из дорсальных клеток IPE индуцирует формирование нового хрусталика. Индукция хрусталика хозяина из дорсальной радужки также наблюдается в глазу с вентральным имплантатом. Индукция хрусталика не наблюдается при использовании агрегата, приготовленного из вентральных клеток IPE; однако при гиперэкспрессии гена six 3 в присутствии ретиноевой кислоты наблюдается индукция хрусталика из вентрального агрегата.

Кроме того, после завершения развития наблюдается индукция хрусталика хозяина из дорсальной части радужной оболочки глаза. Этот метод открыл исследователям в области регенерации хрусталика возможность изучить роль различных генов в новом ракурсе.