Простые висячей капли культуре клеток Протокол Генерация 3D сфероидов

Целью данного эксперимента является создание 3D-подобных тканевых структур. Это достигается путем предварительного сбора культивируемых клеток с последующим получением суспензии одиночных клеток. Затем капли суспензии клеток наносятся на внутреннюю сторону перевернутой крышки чашки для культивирования тканей.

Затем крышку переворачивают и накрывают ею увлажняющую камеру. Заключительный этап — инкубация висячих капель в течение 24–48 часов для формирования агрегатов. После этого их можно перенести в шейкер-инкубатор с водяной баней и инкубировать в течение еще пяти дней.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие различия в когезии агрегатов или сортировке клеток с помощью анализов на уплотнение, анализа симметрии поверхности ткани или эпифлуоресцентной микроскопии. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как, например, традиционное 2D-культивирование тканей, является то, что клетки, выращенные в 3D, более точно имитируют клеточные взаимодействия, происходящие в тканевой среде. Я продемонстрирую этот метод, чтобы показать, что он настолько прост, что с ним справится даже главный исследователь (PI).

Для начала эксперимента соберите адгезивные клетки при 90% конфлюэнтности. Сначала аспирируйте культуральную среду и дважды промойте клеточный слой раствором PBS. Затем аспирируйте PBS и пипеткой нанесите два миллилитра 0,05% раствора трипсина в EDTA на монослой.

Поместите планшет в инкубатор для культур тканей при 37 °C и инкубируйте до тех пор, пока клетки не открепятся. Затем извлеките планшет из инкубатора и остановите процесс тризинизации, добавив 2 мл полной среды.

Используйте пипетку на 5 мл для тритурации смеси до полного суспендирования клеток. Затем перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте пипеткой 40 µL раствора ДНК с концентрацией 10 mg/mL в клеточную суспензию и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут.

Кратковременно перемешайте суспензию клеток на вортексе, затем центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут. После завершения центрифугирования аспирируйте супернатант S и удалите его, затем ресуспендируйте осадок в 1 mL полной среды для промывки. Повторите центрифугирование и ресуспендируйте осадок в 1 mL полной среды.

Затем проведите подсчет клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра. Доведите концентрацию клеточной суспензии с помощью среды до конечного значения 2,5 × 10⁶ клеток/мл. После этого переходите к формированию висячих капель.

Подготовьте увлажняющую камеру, сняв крышку с 60 миллиметровой чашки для культивирования тканей и пипеткой внеся 5 мл PBS на дно чашки. Переверните крышку чашки и нанесите на ее внутреннюю сторону до 20–10 капель суспензии клеток объемом 1 µL каждая. Убедитесь, что капли расположены на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы они не соприкасались.

Осторожно установите крышку с каплями культур обратно на чашку с PBS. Поместите планшет с культурами в инкубатор для культур тканей. Установите температуру 37 °C, содержание carbon dioxide 5% и влажность 95% и инкубируйте в течение ночи.

Ежедневно контролируйте состояние капель и продолжайте инкубацию до тех пор, пока не сформируются клеточные пласты или агрегаты. После формирования клеточных пластов или агрегатов перенесите их в стеклянные колбы с круглым дном, содержащие 3 mL полной среды. Инкубируйте колбы с клеточными пластами или агрегатами в shaking water bath.

Образцы выдерживают при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение примерно 24 часов, пока образование стероидных телец не станет заметным под стереомикроскопом. После формирования стероидных телец влияние экспериментальных манипуляций на их образование можно количественно оценить в соответствии с процедурой, описанной в письменном протоколе. Кроме того, теперь можно визуализировать интеркаляцию в мембрану любых ранее добавленных флуоресцентных красителей с помощью флуоресцентной микроскопии.

На данном изображении, полученном с помощью микроскопа в светлом поле, продемонстрирована агрегация клеток рака предстательной железы крысы MLL после 18 часов инкубации методом висячей капли. На снимке виден второй агрегат клеток MLL, сформировавшийся спустя 18 часов культивирования методом висячей капли. Данные клетки культивировались в присутствии 25 micromolar ингибитора MEK PD 9 8 0 5 9, что привело к образованию существенно более компактного клеточного агрегата.

Здесь продемонстрирована разница в размере агрегатов между культурой MLL в висячих каплях, обработанной ингибитором MEK, и необработанным контролем. Звездочка обозначает статистически значимое различие при P менее 0,0001. Данный результат, определенный с помощью t-критерия Стьюдента при сравнении необработанных агрегатов и агрегатов, обработанных ингибитором MEK, указывает на то, что обработка ингибитором MEK приводит к формированию значительно более мелких и компактных агрегатов.

Данное изображение было получено с помощью стереомикроскопа Nikon Smz 800 и иллюстрирует стероид, образовавшийся в результате инкубации клеток эмбриональной печени цыпленка в культуре «висячей капли» в течение 18 часов, с последующим помещением в шейкер-термостат при 37 °C на 48 часов. Это изображение, полученное с помощью конфокального микроскопа, демонстрирует процесс сегрегации (сортировки), который происходит при совместном культивировании определенных популяций клеток методом «висячей капли»; перед началом культивирования в «висячих каплях» клетки эмбриональной печени цыпленка были окрашены мембранным интернализирующим красителем pkh two.

Клетки сердца окрашивали красителем PKH 26. Затем клеточные суспензии смешивали и выносили в виде висячих капель. Культивирование проводили в течение 18 часов, после чего следовала 48-часовая инкубация в shaking water bath при 37 °C.

На оптическом срезе видно, что клетки сердца, окрашенные в желтый цвет, окружены клетками печени. Здесь псевдоокрашены в синий цвет два клона клеток nardi и трансфицированных L-клеток, экспрессирующих NCA на своей поверхности. В соотношении 2,4 к одному они были окрашены флуоресцентными мембранными красителями PKH 2 и PKH 26, смешанными в равных пропорциях, и культивированы методом висячих капель, как описано ранее.

В данном примере клетки с высокой экспрессией E-кадгерина, окрашенные в зеленый цвет (псевдоцвет), окружены клетками с более низким уровнем экспрессии E-кадгерина, которые окрашены в красный цвет (псевдоцвет). После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает 30 минут или меньше.