Импульсные наддува нервных клеток травматического Исследование мозговой травмы

Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы подвергнуть культивируемые клетки головного мозга импульсному воздействию давления и наблюдать за результатом для изучения черепно-мозговой травмы. Это достигается путем предварительного индуцирования нейрональной дифференцировки клеток, культивируемых с использованием ретиноевой кислоты. Затем нейрональные клетки помещаются в устройство для создания давления в клетках на основе ksky bar и подвергаются импульсному давлению в величине и продолжительности, соответствующих черепно-мозговой травме, вызванной взрывом.

Наконец, клетки подвергают молекулярно-биологическим анализам для оценки повреждений клеток и возможных механизмов черепно-мозговой травмы. Результаты микроскопического исследования демонстрируют гибель нейронов и потерю структуры аксонов нейритов при импульсном повышении давления величиной 2 MPa и длительностью 0.7 ms. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как жидкостная перкуссия, является отсутствие фаз отрицательного давления и точный контроль длительности воздействия.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области черепно-мозговых травм (ЧМТ), такие как определение порога гибели или повреждения нервных клеток в зависимости от импульсного давления, его величины, продолжительности и формы нагрузки. Хотя до сих пор в нашей группе этот метод использовался для изучения ЧМТ, вызванных взрывной волной, он также может быть применен для других типов травм, например, при ударных ЧМТ. Процедуру продемонстрируют Мэтью, аспирант из лаборатории профессора Чэнь Фан, и Ли Ха, техник из моей лаборатории.

В данном эксперименте используется установка Ksky, настроенная как аппарат для создания давления в клетках. Аппарат состоит из двух шестиметровых стержней из алюминиевого сплава, подвешенных на выровненных латунных подшипниках, и камеры для давления клеток in vitro. Камера для давления клеток, зажатая между стержнями, представляет собой цилиндр с поршнем.

В основании полости цилиндра имеется небольшое отверстие с резьбой, которое служит для отвода воздуха и избытка жидкости при установке образца клеток. Поршень изготовлен из той же трубки, что и стержень, и обмотан двумя или тремя слоями тефлоновой ленты. Заглушка фиксирует стеклянные покровные стекла двумя маленькими винтами из нержавеющей стали.

В данной демонстрации используются клетки нейробластомы человека линии SH SY 5Y. Однако данный протокол применим ко многим моделям клеточных культур. Клетки выращивали на стеклянных покровных стеклах диаметром 18 мм с плотностью 3000 клеток на квадратный сантиметр.

В дополненной среде DMEM во время инкубации клеток индуцируйте их дифференцировку, добавив в среду 10 µM ретиноевой кислоты на семь дней, при этом заменяйте среду каждые два дня. На седьмой день клетки демонстрируют хорошо развитую структуру нейритных аксонов и готовы к помещению в камеру высокого давления. Стерилизуйте все детали камеры высокого давления в автоклаве и храните их под УФ-светом во время сборки камеры.

В стерильном боксе убедитесь, что винт вентиляционного отверстия в камере неплотно зафиксирован в воздушном клапане. Заполните камеру свежеприготовленной теплой питательной средой до основания полости. Затем закрепите винтом предметное стекло с культурой клеток на колпачке поршня клетками наружу и осторожно установите поршень в полость камеры.

Выкрутите вентиляционный винт, наклоните вентиляцию вверх и переместите поршень в камеру до ранее определенной контрольной линии. Таким образом в камере надвика останется примерно шесть миллиметров жидкости. Избегайте появления пузырьков воздуха; продезинфицируйте вентиляционный винт и закрутите его обратно, чтобы обеспечить герметичность камеры.

Камера не должна протекать при статической нагрузке. Сбросьте систему штанги Ksky. Переместите тяжелую массу обратно в исходное положение и установите стопорный болт.

Стопорящий болт создает прижимное усилие, которое предотвращает перемещение падающего стержня до момента разрыва штифтов. Затяните новый стопорящий болт с помощью гидравлического домкрата примерно до 200 PSI. Используйте винтовой домкрат, чтобы сжать секцию предварительного натяжения падающего стержня до давления, немного превышающего требуемое значение, а затем немного ослабьте его, чтобы полностью задействовать трение винта домкрата. Теперь настройте систему сбора данных, так как процесс подачи давления занимает около одной миллисекунды.

Установите частоту дискретизации 1 МГц, используя тензорезисторы с сопротивлением 2000 Ом в схеме моста Уитстона. Напряжение на передающем стержне должно быть установлено на уровне 45 В. Установите камеру с ячейкой так, чтобы поршень был обращен к передающему стержню.

Поместите кювету в V-образный блок, опирающийся на небольшой лабораторный домкрат, и выровняйте ее по двум направляющим. Слегка смажьте каждую поверхность соприкосновения и удалите воздух между прилегающими поверхностями, осторожно притирая их друг к другу. Теперь система подготовлена к работе.

Активируйте систему сбора данных и проведите испытание, быстро нажав на рычаг гидравлического привода зажима. Это приведет к разрыву стопорного болта, в результате чего зажим разомкнется, и на клетки будет воздействовать волна давления. После завершения испытания извлеките предметное стекло из камеры в ламинарном шкафу и приступите к анализу поведения клеток.

При наличии опыта аппарат позволяет создавать давление примерно для девяти предметных стекол с клеточными культурами в час. При анализе данных в начале сигнала передаваемой полосы могут наблюдаться ошибки, вызванные пузырьками воздуха, однако в данной демонстрации они отсутствуют.

Если полоса пропускания достаточно длинная, то наиболее важные данные должны начинаться с первого возмущения и заканчиваться там, где измерения показывают отрицательное давление; этот показатель напряжения пропорционален напряжению, воздействующему на клетки, согласно анализу тензометрического датчика. Продолжительность transmitted-импульса может быть короче, чем продолжительность падающего импульса. Если в жидкости внутри камеры создания давления в ячейке за trapped-пузырек воздуха, амплитуда transmitted-импульса может не превышать амплитуду падающего импульса, но перед разгрузкой должно наблюдаться достаточно длительное плато.

В противном случае в герметичной камере либо остался большой пузырек воздуха, либо нарушена соосность сборки и стержня. После создания давления клетки можно осмотреть немедленно или продолжить их инкубацию для последующего анализа. Сравните клетки, подвергнутые воздействию давления, с контрольными клетками в камере, которые подвергались идентичной обработке, но не подвергались воздействию давления, чтобы оценить изменения длины нейритов с помощью оптической микроскопии в различные моменты времени после инкубации.

Иммунофлуоресцентное окрашивание актина может быть использовано для оценки изменений цитоскелета. Также может быть использовано антитело к микротрубочко-ассоциированному белку 2 (MAP2) для визуализации изменений одного из ключевых нейрональных маркеров.

Для оценки влияния импульсного повышения давления на экспрессию нейрональных и апоптотических генов при необходимости используйте стандартные методы молекулярной биологии, такие как R-T-P-C-R. Достаточное количество клеточных лизатов для иммуноблоттинга можно собрать из нескольких идентично подвергнутых воздействию давления образцов клеток. В данном примере с профилем повышения давления установка ksky bar успешно применила однократный импульс давления уровнем 2 MPa продолжительностью около 0.7 ms к культивируемым нейрональным клеткам, что видно на изображениях в оптическом микроскопе; нейрональные клетки человека SHSY five Y, подвергнутые импульсному давлению 2 MPa, демонстрируют выраженную деградацию аксонов нейритов по сравнению с контрольными клетками, не подвергавшимися воздействию давления.

При выполнении данной процедуры камеру нагнетания жидкости следует всегда держать таким образом и ни в коем случае не так, поскольку это подвергнет клетки отрицательному давлению после завершения процесса. Данный метод открыл исследователям в области нейробиологии путь к изучению клеточных механизмов черепно-мозговой травмы в контролируемых условиях позитивного давления. Мы благодарим Центр механики травмы Армии UNL за финансовую поддержку.