Анализ кальция Биолюминесценция для функционального анализа Mosquito ( Aedes aegypti) И Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G-белком рецепторы

Общая цель следующего эксперимента — проанализировать взаимосвязь «структура — активность» синтезированных нейропептидов членистоногих с их когнативными GPCR. Это достигается путем трансфекции пустых клеток яичника китайского хомячка (CHO-K1) вектором экспрессии желаемого GPCR для получения стабильных трансформированных клеточных линий, производных от одной клетки; на втором этапе стабильная клеточная линия трансфецируется плазмидой, несущей репортер GCaMP, для измерения внутриклеточной биолюминесценции в планшетном биолюминесцентном анализе уровня кальция. Затем проводится планшетный биолюминесцентный анализ уровня кальция с целью определения концентрации цитоплазматического кальция после добавления пептидного лиганда к этим рекомбинантным клеткам.

Полученные результаты демонстрируют различия в единицах биолюминесценции при воздействии на рекомбинантные клетки структурно различных пептидов или разных концентраций пептидов, основанные на вызванном высвобождении внутриклеточного кальция, которое регистрируется репортером коррином в планшетном анализе. Основным преимуществом использования стабильно трансформированных клональных клеточных линий, экспрессирующих рекомбинантные GPCR, по сравнению с транзиентными протоколами экспрессии, является более равномерный уровень экспрессии рецепторов, что обеспечивает воспроизводимость и согласованность результатов. Кроме того, нацеливание белка аквариума на митохондрии позволяет проводить высокочувствительные измерения уровня кальция с помощью биолюминесценции. В сегодняшнем эксперименте примут участие два аспиранта, Шалле и Саймон Керш, а также постдок из моей лаборатории.

Для создания стабильных клеточных линий начните с культивирования пустых клеток яичника китайского хомячка K1 при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Поддерживайте пустые клетки в ростовой среде с 1х антибиотиками и антимикотиком, когда клетки начнут активно расти. Посейте клетки яичника китайского хомячка K1 в флаконы для культивирования тканей T25 и выращивайте их в течение ночи в ростовой среде без антибиотиков до достижения конфлюэнтности примерно 30%.

Перед трансфекцией подготовьте вектор экспрессии ДНК, содержащий интересующий GPCR, согласно описанию в письменном протоколе. Смешайте ДНК со 100 µL среды Optum с пониженным содержанием сыворотки.

Смешайте 6 µL реагента для липофекции со 100 µL бессывороточной среды F 12 K и инкубируйте при комнатной температуре от 30 до 45 минут. После инкубации осторожно смешайте растворы ДНК и липофекционного реагента, добавляя один раствор в другой по каплям. Оставьте смесь в пробирке объемом 15 мл при комнатной температуре на 10–15 минут.

Осторожно добавьте смесь для трансфекции по каплям в 1,8 миллилитра свежей среды F 12 K. Затем промойте клетки PBS и добавьте полученный раствор для трансфекции к клеткам. Последуйте инкубации в течение 18 часов.

Замените среду на среду F 12 K с добавлением 10% FBS без антибиотиков и инкубируйте клетки в течение ночи до следующего дня. Расселите клетки в две колбы T 25 с использованием среды F 12 K с добавлением 10% FBS без антибиотиков, как описано в письменной процедуре. Инкубируйте в течение дополнительных 18 часов.

Замените среду на селективную среду. Затем культивируйте клетки в селективной среде в течение трех-четырех недель. Это позволит отобрать клетки, в геномную ДНК которых плазмида была встроена стабильно.

Продолжайте поддерживать жизнеспособность клеток, используя поддерживающую среду; периодически замораживайте клеточные линии, чтобы предотвратить их потерю в случае неожиданного загрязнения. Для селекции клональных клеточных линий сначала проведите трипсинизацию и центрифугируйте клетки в поддерживающей среде, как описано в письменном протоколе. Затем ресуспендируйте клетки в 5 mL поддерживающей среды.

Отберите 0,5 мл клеточной суспензии и добавьте 4,5 мл свежей поддерживающей среды для получения разведения 10-кратного, затем перенесите по 100 мкл этого 10-кратного разведения в 12 лунок планшета на 96 лунок для селекции одиночных клеток. Продолжайте делать 10-кратные серийные разведения этих клеток примерно 19 раз, чтобы теоретически получить конечную суспензию с концентрацией одной клетки на 100 мкл, и перенесите по 100 мкл каждого серийного разведения в 12 лунок планшета на 96 лунок. После 18 часов инкубации осмотрите планшеты на 96 лунок под инвертированным световым или флуоресцентным микроскопом и отметьте лунки, в которых, по всей видимости, содержится одна одиночная клетка или две клетки, которые явно образовались в результате деления одной клетки.

Проводите ежедневный осмотр планшетов, заменяя среду каждые три дня. Оставьте клетки расти на одну неделю, пока они не достигнут примерно 80% конфлюэнтности. Затем промойте отмеченные лунки 200 µL PBS и трипсином.

Промойте их 100 µL раствора PBS-трипсин-ЭДТА. Удалите раствор PBS-трипсин-ЭДТА. Добавьте 100 µL поддерживающей среды и перенесите клетки из каждой маркированной лунки в одну лунку шестилуночного планшета, содержащую 1 mL поддерживающей среды.

После культивирования клеток в шестилуночном планшете в течение трех дней перенесите их в отдельные флаконы T 25. Периодически замораживайте клеточную линию, чтобы иметь возможность восстановить её в случае потери стабильности характеристик клеток. Чтобы определить клеточную линию с максимальным откликом, протестируйте перенесенные клетки с помощью анализа биолюминесценции кальция, используя активный лиганд, такой как рецептор, пептид, лиганд или другой положительный контрольный агонист.

Метод анализа кальциевой биолюминесценции будет подробно продемонстрирован далее в этом видео. Перед началом эксперимента повторно проведите селекцию единичных клеток. При выборе клональных клеточных линий для анализа и их поддержании в культуре крайне важно отслеживать номер пассажа, так как клетки с большим числом пассажей могут перестать функционировать в колбе T 25.

Вырастите клеточные линии, экспрессирующие нужный рецептор, в поддерживающей среде до достижения примерно 90% конфлюэнтности. После трипсинизации и центрифугирования ресуспендируйте клетки в поддерживающей среде, разведите их примерно в 10 раз поддерживающей средой и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Затем доведите концентрацию клеток примерно до 2 × 10⁵ клеток/мл. Внесите по 2 мл клеточной суспензии в каждую лунку планшета на 6 лунок и инкубируйте планшет в течение 24 часов; к этому моменту конфлюэнтность клеток должна составить около 60% перед началом проведения анализа кальциевой биолюминесценции на планшете.

Подготовьте интересующий вас репортерный ген в конструкции экспрессионного вектора. В данном случае используется репортер кворума с митохондриальной экспрессией. Затем трансфицируйте клетки одним микрограммом этой репортерной плазмиды согласно описанному в письменном протоколе методу.

После инкубации клеток в 6-луночном планшете в течение 24 часов проведите трипсинизацию, центрифугирование и ресуспендирование; доведите концентрацию клеток до 400 000 клеток на миллилитр и перенесите по 100 µL в каждую лунку белого 96-луночного микротитровального планшета с тонким дном. Инкубируйте еще 24 часа до достижения примерно 80% конфлюэнтности. Это оптимальная концентрация клеток для анализа биолюминесценции. Следующие этапы должны выполняться в темноте, но здесь они показаны при освещении.

Для демонстрационных целей приготовьте достаточное количество безкальциевой среды DME, содержащей 5 µM CHO terezin, из расчета 90 µL на лунку. Удалите старую среду из планшета и добавьте по 90 µL в каждую лунку. Инкубируйте планшеты в течение трех часов в темноте при 37 °C и 5% CO2, после чего клетки будут готовы к тестированию.

Данная демонстрация проводится с использованием планшетного ридера Nova star в режиме биолюминесценции. Перед началом очистки помпы прибора должны быть помещены в держатель для планшетов в темноте. Растворите пептиды в пробирке EOR объемом 1.5 milliliter.

Используйте достаточное количество DME без кальция и среды для добавления 10 µL пептида в 10-кратном разведении в каждую лунку. Перед использованием настройте глубину аспирации и определение положения раствора пептида. Добавьте к клеткам 10 µL пептида и немедленно начните запись эмиссии света.

В данной демонстрации прибор настроен на регистрацию светового излучения на длине волны 465 нанометров для каждой лунки каждые две секунды в течение общего времени 50 секунд. После завершения цикла промойте помпы прибора. Повторите этот процесс для каждого образца пептида, сохраните данные и снова промойте помпы прибора после проведения анализа.

Данные об излучении света из каждой лунки автоматически переносятся программным обеспечением в таблицу Microsoft Excel. Скопируйте данные из Excel в программу Prism Software 4.0. Постройте график, где по оси x будут отложены различные концентрации пептида, а по оси y — единицы биолюминесценции.

Для оси Y выберите анализ аппроксимации нелинейной регрессионной кривой, чтобы получить кривые зависимости ответа от концентрации для каждого пептида и соответствующие им значения EC 50. Для анализа данных каждый эксперимент должен быть повторен трижды. При экспрессии в клетках CHO-K1 кининовый рецептор комара Aedes aegypti проявил себя как мультилигандный рецептор и функционально реагировал на концентрацию до 1 nM.

Для трех эндогенных кининов *eighties*, протестированных по отдельности с помощью анализа биолюминесценции кальция на планшете, были определены статистически различающиеся значения EC 50: около 16 nanomolar для *eighties aegypti* кинина 3, 26 nanomolar для *eighties aegypti* кинина 2 и 49 nanomolar для *eighties aegypti* кинина 1. Это определило иерархию активности, в которой кинин *eighties* 3 оказался наиболее активным, а кинин *eighties* 1 — наименее активным. Здесь представлено сравнение активности шести аналогов кинина на основе альфа-аминоизомасляной кислоты на клеточной линии K1 китайского хомячка, экспрессирующей рецептор кинина клеща, с использованием анализа биолюминесценции кальция на планшете.

Ось Y представляет собой процент максимальных единиц биолюминесценции для каждого аналога, выраженный как отношение биолюминесценции, наблюдаемой при данной концентрации, к максимальному ответу, зафиксированному при всех протестированных концентрациях для каждого аналога; гексапептидный аналог кинина F-F-F-S-W-G амид служит положительным контролем активности рецептора. Аналог кинина с одной заменой, двойной F амино-изомасляная кислота WG амид, оказался более активным, чем положительный контроль гексапептидный аналог кинина; наиболее мощным среди протестированных аналогов с двойной заменой оказался аналог кинина с двумя заменами на аминомасляную кислоту — аминомасляная кислота FF аминомасляная кислота WG амид. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как экспрессировать A-G-P-C-R и получать клональные клеточные линии для анализа взаимосвязи «структура — активность» лигандов на рецепторах с помощью анализа биолюминесценции кальция.