Axon Stretch Рост: механотрансдукции нейронных рост

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы приложить растягивающую силу к аксональному отростку нейрона, чтобы стимулировать и поддерживать его рост. Это достигается путем наложения нейронов в компьютере, управляемом реактором, на микроманипулируемую буксирующую подложку. После нанесения покрытия нейроны культивируются в течение одной недели, в течение которой аксоны выходят на неподвижный субстрат за счет удлинения конуса роста.

Далее рост аксона на растяжение осуществляется путем буксировки покрытых клетками тел от окончаний аксонов, прилипших к неподвижной подложке. Метод тканевой инженерии роста аксонов способен обеспечивать устойчивые темпы роста до 10 миллиметров в сутки, в результате чего на основе микроскопического анализа образуются длинные везикулярные пучки увеличенных аксонных путей. Основное преимущество этой методики перед другими методами, такими как удлинение тока роста, заключается в том, что растяжение аксона позволяет экспериментировать с выращиванием следов аксона до любой желаемой длины за более короткие промежутки времени.

Последствия растяжения аксонов или это позволяет нам воссоздать биомеханические сигналы, которые стимулируют рост нервов. Эти сигналы могут быть изучены с целью их использования и разработки новых стратегий лечения больных или поврежденных нервов. Таким образом, метод роста Axon stretch может помочь ответить на ключевые фундаментальные вопросы о развитии и поддержании нервной системы.

Важно отметить, что мы можем исследовать механизмы, которые позволяют аксонам расти быстрее, чем мы думали. Система биореактора для растяжения Axon состоит из трех основных компонентов. Во-первых, камера биореактора, в которой нейроны культивируются и растягиваются.

Во-вторых, автоматизированный стол линейного перемещения, который прикладывает силы растяжения. И, наконец, контроллер привода шагового двигателя с программным обеспечением для управления ростом растяжения. Здесь протокол демонстрируется с использованием миниатюрной системы, способной работать под микроскопом.

Изготовление опытных образцов биореактора осуществлялось с помощью вертикального фрезерного станка для обеспечения биосовместимости и простоты стерилизации культуры. Компоненты камеры были изготовлены из полиэфирэфиркетонов, устойчивых к коррозии, для завершения сборки были использованы три крепежа из нержавеющей стали 16. Камера для культивирования биореактора содержит растягивающую раму, регулируемый буксировочный блок, буксировочные стержни для внешних манипуляций и одноразовые буксировочные и стационарные субстраты для культур.

Автоматизированный стол линейного перемещения состоит из стола линейного перемещения с шаговым двигателем, установленным на столе delrin. Программное обеспечение, называемое P si programmer, используется для программирования и мониторинга контроллера привода, который взаимодействует с шаговым двигателем. Делают подложки для жгута культур, разрезав пленку LAR на тонкие полоски, примерно 0,5 на 2,5 сантиметра.

Слегка отшлифуйте нижнюю треть субстрата для буксируемых культур с обеих сторон, используя мелкую наждачную бумагу с зернистостью 1,200, чтобы облегчить рост аксонов из буксирующих субстратов на неподвижный субстрат. Использование разделительной вкладки помогает шлифовать более равномерно. Отрежьте кусок LAR размером пять на семь сантиметров или используйте стеклозащитный лист номер один в качестве неподвижной подложки.

Субстраты культур и камеру биореактора очистить разбавленным раствором Алкана и тщательно промыть деионизированной водой. Простерилизовать субстраты культур путем погружения в 70% этанол на 30 минут. Автоклав стерилизует камеру биореактора в автоклавируемом контейнере.

После стерилизации перенесите субстраты для культур и камеру биореактора в колпак для культуры тканей и дайте высохнуть на воздухе. Коробка с наконечниками для пипеток может быть использована для сушки субстратов для культур. Вставьте субстраты для буксируемой культуры с помощью стерильных ватных тампонов.

Приклейте субстраты для буксировочной культуры к ножкам буксировочного блока. С помощью тонкого слоя кремния RTV подложка должна быть приклеена на нешлифованную часть, при этом следует избегать контакта с отшлифованной поверхностью культуры. Далее приклейте неподвижный субстрат культуры на дно камеры биореактора.

Удалите излишки клея и воздушные карманы, аккуратно прижав сухой тампон к дну неподвижной подложки. Дайте камере высохнуть в течение двух полных дней внутри колпака для культуры тканей. Через два дня отрегулируйте стойки буксировочного блока, чтобы добиться перекрытия в два-три миллиметра между концами стандартных буксировочных подложек и неподвижной подложкой.

Решающее внимание следует обратить на размер перекрытия. Если он слишком большой, кончики буксирующих субстратов будут отклоняться от неподвижной подложки и уменьшать количество аксонов, охватывающих перекрытие. Расположите буксировочный блок в исходном положении с убранными тягами внутрь биореактора.

Затяните иммобилизационные винты, чтобы предотвратить смещение тяг. Перед растяжением роста, работая в тканевой культуре, вытягивали один миллилитр высокомолекулярного поли-делицина в сыворотке свободной среды на границе субстрата каждой дорожки. Дать раствору настояться в течение одного часа при комнатной температуре, после часа трижды промыть деионизированной водой, после чего провести окончательное промывание питательной средой пластиной дорсального корневого ганглия от крысят Е 16 на отшлифованную буксировку культурального субстрата.

С помощью стереомикроскопа сначала разведите эксплан в каплях с помощью чашек Петри, а затем соберите три-четыре баклажана с помощью пластины-пипетки объемом 100 микролитров. Х растений на краю буксировки подсыпаем субстратом в небольшую лужу до одного миллилитра культуры. Среды достаточно, чтобы предотвратить испарение в течение нескольких часов, ограничивая при этом движение баклажанов.

Застегните крышку биореактора и переложите в инкубатор на один час, чтобы баклажаны успели прилипнуть. Через час заполните биореактор питательной средой в точке, наиболее удаленной от баклажанов, чтобы избежать их смещения. Инкубируйте биореактор в течение пяти дней, чтобы позволить нейронам DRG распространить аксональные отростки на неподвижный субстрат.

В кожухе для тканевых культур заполните резервуары биореактора фосфатно-соевым буфером для увлажнения камеры и ограничения аберраций сред. Выполните окончательную замену среды, заполнив дорожки биореактора до емкого посадочного места. Биореактор в составе автоматизированного стола линейного перемещения в неувлажненном инкубаторе.

Закрепите адаптер буксирной тяги к тяговым тягам. Использование программного обеспечения Cy. Переместите сцену толчковой поверхностью на стол линейного перемещения, чтобы она совпала с адаптером буксирной штанги, и закрепите ее на сцене для удобства.

Заранее подготовьте последовательности действий программиста, чтобы манипулировать сценой с определенным шагом. Перед началом программы роста Axon Stretch ослабьте иммобилизационные винты на камере биореактора. Растяжка выполняется ступенчато, выполняя ряд небольших шагов смещения, разделенных периодами отдыха.

Эта парадигма начинается с шага в два микрона каждые 172 секунды, что приводит к чистому растяжению на один миллиметр в течение первых 24 часов после предварительного натяжения. Через один день скорость растяжения можно ускорить, увеличив размер шага смещения или уменьшив время отдыха. Здесь представлены репрезентативные результаты процесса роста растяжения аксонов.

Сначала клетки внутри пластинчатых имплантатов мигрируют на буксирующий субстрат. В течение следующих пяти дней ростовые шишки распространяют аксональные отростки на неподвижный субстрат. Как только конусы роста удлинятся по крайней мере на один миллиметр в поперечнике неподвижного субстрата, начинается рост растяжения аксонов.

Буксирующая подложка перемещается в сторону от конусов роста AED В течение ряда этапов эластичность осных слоев сразу становится очевидной по мере их растяжения. Как правило, аксоны изначально тонкие, но в течение нескольких часов вступают в фазу роста, в которой они восстанавливаются и сохраняют свой диаметр. В течение 24 часов непрерывного роста растяжения аксоны демонстрируют повышенную толерантность к растяжению и способны поддерживать увеличение скорости растяжения.

По мере того, как аксоны становятся еще длиннее и циркулируют FAS, они демонстрируют все большую толерантность к растяжению. Здесь очевидна флотация вытянутых аксонов, поскольку биореактор намеренно толкается вручную. Иногда аксоны могут отсоединяться от неподвижной подложки из-за недостаточной адгезии.

Это наиболее распространенный отказ, который чаще всего возникает, если начальный размер ступени слишком велик или неподвижная подложка была покрыта недостаточно. Здесь часть аксонов отделяется от неподвижного субстрата в начале роста растяжения из-за слишком большого размера шага. При выполнении этой процедуры важно уделить время подготовке интерфейса подложки.

Носок и подложка должны перекрывать неподвижную подложку на два-три миллиметра, а DRG должна быть покрыта как можно ближе к границе раздела во время роста растяжения. У вас будет уникальная возможность изучить рост аксонов с помощью живых флуоресцентных зондов или лизиса клеток по мере их растяжения, чтобы изучить экспрессию генов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать приложенное натяжение для стимулирования роста аксонов.

Используя эту технику, мы обнаруживаем, что аксоны обладают удивительной способностью расти быстрее, чем мы думали, и создавать связи, которые не могут быть достигнуты никакими другими средствами.