В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

Целью этой процедуры является выполнение стабильной визуализации in vivo в спинном мозге мыши с использованием двухфотонной микроскопии. Это достигается путем предварительного обезболивания животного анестетической смесью, которая обеспечивает устойчивый, но спокойный ритм дыхания. Вторым этапом процедуры является обнажение позвоночного столба на желаемом уровне, а затем выполнение ламинэктомии для обнажения основного спинного мозга, чтобы его можно было визуализировать in vivo.

Третьим этапом является установка животного на устройство для стабилизации позвоночника. Заключительным этапом является изоляция обнаженного сегмента спинного мозга. В конечном итоге при подготовке к визуализации in vivo могут быть получены результаты, детализирующие динамическое поведение клеток и их взаимодействие с другими типами клеток или структурами в живом спинном мозге с помощью покадровой визуализации in vivo с использованием двухфотонной микроскопии.

Основное преимущество этого метода по сравнению с предыдущими попытками визуализации спинного мозга in vivo заключается в том, что он генерирует данные визуализации дороги in vivo, которые не требуют постобработки и могут быть немедленно оценены и использованы для дальнейшего анализа. Применение этого метода распространяется на лечение после травмы или заболевания спинного мозга, потому что, например, он позволяет нам изучать прогрессирование аксональной дегенерации или регенерации после, например, травмы, в реальном времени, помимо травмы спинного мозга. Этот метод может быть использован для изучения прогрессирования воспалительных или нейродегенеративных процессов на животных моделях заболеваний, таких как рассеянный склероз или боковой амиотрофический склероз, где патология заболевания ярко выражена в спинном мозге.

Начните процедуру с взвешивания животного. Далее обезболивают животное путем введения обезболивающей смеси внутрибрюшинно. Выполняйте регулярное пощипывание пальцев ног, чтобы обеспечить глубокую анестезию животного на протяжении всего эксперимента, и добавляйте половину первоначальной дозы анестетика, ежечасно или по мере необходимости.

Затем нанесите мазь искусственных слез на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание и повреждение роговицы. Подстригите шерсть на спине животного с помощью триммера и сбрейте оставшуюся шерсть острым лезвием. Продезинфицировав выбритый участок, поместите животное под микроскоп и начните процедуру с того, что сделайте небольшой продольный разрез примерно на 1,5 сантиметра над нужным уровнем позвоночника.

Обнажите мускулатуру спины, осторожно втягивая подкожную соединительную ткань. Затем аккуратно отделите паравертебральные мышцы от позвоночного столба на нужном уровне. Делайте как можно меньше разрезов, чтобы отделить мышцы с обеих сторон каждого остистого отростка.

После этого соскребите отделенные мышцы с поверхности ламината. При необходимости используйте прижигание небольших сосудов, чтобы остановить любое незначительное кровотечение. Продолжайте соскабливать мышцы до тех пор, пока вы не обнажите основной ламинат и не сможете четко определить, какой из них вы собираетесь удалить.

Чтобы подготовить места входа для спинномозговых зажимов с каждой стороны позвоночного столба, вставьте кончики изогнутых ножниц между паравертебральными мышцами и осторожно сместите мышечную ткань, чтобы создать четыре кармана, в которые будут вставлены зажимы. Поднимите позвоночный столб с помощью щипцов с прямым кончиком зуба, чтобы обеспечить безопасное введение изогнутых ножниц с тупым кончиком под пластинку, не касаясь спинного мозга. Затем выполните ламинэктомию, медленно разрезая кость с одной стороны, а затем с другой стороны, используйте ватный тампон или вставьте предварительно отрезанный кусочек небольшой гелевой пены для рассасывающегося желатина рядом с разрезом, чтобы ограничить незначительное кровотечение.

После этого используйте предварительно подогретую стерильную искусственную спинномозговую жидкость для промывания тканей. Устройство стабилизации позвоночника было специально разработано с использованием основных компонентов сложных зажимов для спинного мозга Nagate STSA и адаптера для удержания головы Nagate MA six N. Опорная пластина из нержавеющей стали была изготовлена для удержания двух частей наги в горизонтальном положении, так что голова животного поддерживается, а его позвоночный столб и хвост зажаты.

Имейте в виду, что весь прибор должен помещаться под объективом микроскопа на опущенном предметном столике для стабилизации животного. Сначала поместите его на подъемную площадку на опорной пластине устройства стабилизации позвоночника. После закрепления головы в адаптере для удержания головы поместите спинальный зажим устройства SDSA вдоль передней задней оси животного в заранее подготовленные карманы, фланкируя место ламинэктомии.

Расположите два зажима под углом около 45 градусов относительно оси корда ROS животного, чтобы обеспечить достаточно места для опускания линзы погружения в воду над открытым спинным мозгом. Затем поместите третий зажим у основания хвоста, чтобы тело животного можно было подвешивать после удаления подъемной площадки в эксперименте с визуализацией. Затем соорудите небольшую лунку из гелевого уплотнения вокруг открытого спинного мозга, чтобы облегчить поддержание спинного мозга в спинномозговой жидкости.

Когда вы будете готовы начать визуализацию in vivo, снимите подъемную подушку, поднесите стабилизирующее устройство к предварительно нагретой камере микроскопа и поместите его на опущенный предметный столик микроскопа. Обязательно совместите ламинэктомию с линзой. Осторожно опустите водную иммерсионную линзу в раствор спинномозговой жидкости и убедитесь, что она не касается спинномозговых зажимов или гелевого уплотнения.

Используйте эпифлуоресценцию, чтобы определить интересующую вас область и затем сосредоточиться на ней. Переключитесь в режим лазерного сканирования и выполняйте визуализацию in vivo с использованием соответствующих двухфотонных лазерных фильтров возбуждения, длины волны, дихроики и полосового пропускания для флуоров, присутствующих в ткани изображения. По окончании экспериментов с визуализацией извлеките животное из устройства стабилизации позвоночника.

Тщательно сотрите гелевый герметик с области вокруг ламинэктомии и очистите его. Ну и зашить мышцы спины над ламинэктомией. Затем зашить разрез кожи и смазать его бетадином, показанным здесь в качестве проекции изображений Зака, как они требовались in vivo и впоследствии проецировались вдоль оси Z без выравнивания изображения.

На изображении зеленым цветом показаны высокоплотные GFP-положительные микроглиальные клетки, окруженные кровеносными сосудами красного цвета в спинном мозге. Вот изображение с большим увеличением одной микроглиальной клетки, прикрепленной к стенке кровеносного сосуда, показывающее в деталях некоторые из ее отростков, распространяющихся вокруг сосуда, а некоторые — по направлению к паренхиме спинного мозга. Вот пример повторяющейся визуализации in vivo тех же меченых YFP сегментов аксона, которые были перемещены и визуализированы в спинном мозге одной и той же мыши линии YFPH на двух разных сеансах с разницей в пять дней. Это еще один пример повторяющейся визуализации, показывающей одни и те же сосудистые структуры и клетки микроглии, визуализированные in vivo в спинном мозге в течение двух дней подряд.

Вот репрезентативная последовательность покадровой съемки, которая была получена in vivo из спинного мозга. Эта последовательность подробно показывает динамическое поведение более тонких процессов микроглиальных клеток (зеленым цветом) и их взаимодействие с сосудистой сетью (красным). Со временем исходные изображения были скорректированы только на фоновый шум, яркость и контрастность, а цейтраферный фильм был построен путем последовательного отбрасывания стеков изображений без выравнивания изображения.

Усредняя австралийский отбор отдельных плоскостей, кровеносные сосуды проходят через тот же диапазон Z-плоскостей, что и изображения микроглии. Глубина объема изображения составляет 38 мкм. Это последовательность покадровой съемки, показывающая стабильность метода визуализации на уровне одной плоскости Z.

Быстрая регистрация одной и той же одиночной плоскости Z в спинном мозге гетерозиготной мыши CX three, CR one GFP, обезболенной смесью KXA и помещенной на устройство стабилизации позвоночника, демонстрирует минимальное смещение изображения между последовательными кадрами. Примечательно, что скорость этой последовательности составляла один кадр в секунду, что быстрее, чем частота дыхания мыши. Незначительное остаточное смещение, вероятно, связано с сердцебиением животного.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что количество разрезов должно быть сведено к минимуму и постараться ограничить любое незначительное кровотечение, как только оно произойдет. Теперь, после просмотра этого видео, у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять стабильную визуализацию in vivo в шнуре питания мыши с помощью двух фотомикроскопов.