Протокол для сбора и окрашивания гемоциты от желтой лихорадки комаров Aedes aegypti

Общая цель данной процедуры заключается в сборе и окрашивании гемоцитов комаров. Это достигается путем предварительного введения небольшого объема антикоагулянтного разбавителя в охлажденных комаров. Это позволяет высвободить гемоциты и перевести их в раствор.

Вторым этапом процедуры является удаление ног, крыльев и кончика брюшка комара. В-третьих, в отдельный участок тела комара вводится свежий разбавитель для начала процесса перфузии. Заключительным этапом является нанесение разбавленной гемолимфы на подготовленный предметное стекло, чтобы собранные гемоциты можно было зафиксировать и окрасить.

В конечном итоге с помощью базовой скользящей микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие основные типы и количество гемоцитарных участков, обнаруженных у изучаемого вида комаров. Основное преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как перфузия, заключается в том, что он сочетает в себе простоту перфузии с точностью, обеспечиваемой методами высокого давления при инъекциях, но при этом требует меньше этапов для достижения конечной цели. Наша цель — определить типы гемоцитов и их количество в ответ на иммунные вызовы.

Эту методику демонстрирует Амина Абдул Кум, студентка бакалавриата из моей лаборатории. Перед началом протокола приготовьте раствор для разведения гемолимфы в аликвотах по 1 мл. Храните их при температуре -20 °C и не подвергайте повторному замораживанию неиспользованные части аликвоты.

Теперь на предметных стеклах толщиной 1 мм начертите круги диаметром 1 см. На одного комара требуется одно предметное стекло. Подготовьте вытянутые стеклянные капилляры.

Отломите кончик каждой вытянутой иглы, чтобы создать отверстие. Установите одну иглу в держатель, который присоединен к трубкам и компонентам шприца микроинжектора. Затем удалите пузырьки воздуха из системы трубок и держателя иглы, используя минеральное масло.

Наберите минеральное масло в этот ручной шприц, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха. Под иглой разместите емкость для сбора стекающего масла. Откройте эту часть микроинъектора и заполните её маслом, чтобы удалить все пузырьки.

Этот элемент просто защелкивается на ручном шприце точно так же, как и на другом наконечнике. Медленно введите минеральное масло так, чтобы оно прошло через пластиковую трубку и удалило все имеющиеся пузырьки воздуха. Затем снова наполните верхнюю часть минеральным маслом до тех пор, пока оно не начнет капать.

Затем необходимо снова подсоединить эту часть к стеклянному шприцу, чтобы избежать появления пузырьков воздуха. После этого заполните собранные компоненты минеральным маслом до тех пор, пока вся игла, трубки и шприц не будут заполнены. Теперь микроинъектор готов к использованию для подачи разбавителя.

Затем подготовьте животных: для начала перенесите 15 взрослых самок с помощью аспиратора в небольшой плотный контейнер-клетку, который будет полностью погружен в лед. Комары подвергаются анестезии при иммобилизации холодом, что обычно занимает восемь минут или меньше. Поместите одного анестезированного комара на предметное стекло с лункой, где будет проводиться микроинъекция.

Находясь за микроскопом, наберите 12 µL разбавителя гемолимфы в микроинъектор. Осторожно зафиксируйте комара под микроскопом с помощью пинцета и введите от 3 до 3,5 µL разбавителя. Между седьмым и восьмым сегментами брюшка оно раздуется.

При введении разбавителя можно сделать инъекции трем комарам. Перед повторной заправкой микроинъектора поместите всех комаров, получивших инъекцию, в чистый пластиковый стакан со льдом, где они будут восстанавливаться в течение примерно пяти минут. Во время инкубации антикоагулянтный разбавитель вытесняет гемоциты из внутренних тканей.

Пока первая группа животных восстанавливается в период инкубации, обычно можно ввести препарат еще трем-пяти комарам. По истечении пяти минут, пока насекомые все еще находятся в стакане, подготовьте инъецированных комаров, отрезав им конечности, крылья и кончики брюшка на уровне восьмого сегмента с помощью микроножниц. Будьте осторожны, чтобы не отрезать конечности и крылья слишком близко к грудному отделу или гемолимфе.

Лимф может вытечь. Теперь промойте предметное стекло с насечкой в 70% ethanol и просушите его салфеткой Kimwipe. Под микроскопом поместите одного препарированного комара на внешний край насеченного круга.

Заполните микроинъектор 12 µL свежего разбавителя. Удерживая комара пинцетом, введите от 8 до 10 µL в боковую часть мезоторакса. Будьте осторожны, чтобы после этой инъекции не ввести минеральное масло.

Гемолимфа будет собираться из брюшка в зону круга; осторожно сжимайте брюшко пинцетом, чтобы направить и стимулировать ток гемолимфы. Теперь дайте собранной гемолимфе высохнуть на предметном стекле. Это должно занять около 10 минут.

После этого препарат готов к окрашиванию. Окрасьте каждое стекло по отдельности с помощью Hema three. Погрузите каждое стекло в фиксатор пять раз, удерживая его в течение одной секунды при каждом погружении.

После этого трижды погрузите препарат в раствор один на одну секунду, а затем в раствор два. Теперь промойте деионизированной водой только обратную сторону предметного стекла, не затрагивая лицевую сторону. Высушите лицевую сторону, нанесите покровное стекло с помощью фиксирующего средства и аккуратно прижмите его, чтобы средство полностью заполнило пространство над окрашенной тканью.

Теперь оставьте предметное стекло сохнуть минимум на три часа для достижения оптимальных результатов. Окрашенные гемоциты следует визуализировать и сфотографировать в течение двух недель после этой подготовки. Клетки взрослых самок были идентифицированы с помощью данного протокола.

На первом изображении показан прогемобластический сайт, определяемый по его фаллоидной форме и высокому отношению объема ядра к цитоплазме. Данное изображение представляет собой ENO-цитобласт, определяемый по его фаллоидной форме и соотношению цитоплазмы к ядру. Наконец, здесь представлен гемобластический сайт гранулоцитарного типа.

Она имеет более зернистую текстуру и более овальную форму по сравнению с предыдущими методами инъекций. Данный протокол позволил получить аналогичное общее количество гемоцитов и также определил зернистые клетки как наиболее распространенный тип клеток. После освоения эта методика может быть выполнена за один час для примерно 15–20 комаров при условии правильного проведения.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как правильно вводить комарам dent, как собирать их гемолимфу, а затем как подготавливать гемолимфу для визуализации и получения изображений.