В режиме реального времени Электрические характеристики Сопротивление техника выполнения измерить Вторжение клеточный монослой эндотелиальных раковыми клетками

В этой статье описывается

В этом видео демонстрируется метод мониторинга инвазии монослоя эндотелиальных клеток раковыми клетками с использованием метода, основанного на электрическом импедансе в реальном времени. Во-первых, эндотелиальные клетки пупочной вены человека, называемые ЖЭ, располагаются в 16 луночных ЭПЛ, покрытых золотыми электродами на дне лунки. Для создания конфлюентного монослоя добавляются раковые клетки, которые прикрепляются к ЖЭ и проникают в монослой ОВКВ, нарушая соединения эндотелиальных клеток.

Степень инвазии может быть определена на основе изменений электрического сопротивления. Основное преимущество этой техники или существующих методов, таких как анализ пустой камеры и анализ METROGEL, заключается в том, что взаимодействия эндотелиальных клеток с опухолевыми клетками более точно имитируют метастатический процесс in vivo, а данные получают в режиме реального времени и легче поддаются количественной оценке в отличие от анализа конечных точек для других методов. Хотя этот метод может дать представление о вторжении раковых клеток.

Он также может быть применен к другим системам, таким как исследование клеточных взаимодействий в иммунной системе. Кроме того, начальная фаза эксперимента, на которой мы наблюдаем рост UX-клеток, может быть использована для оценки клеточной пролиферации любой клеточной линии без дальнейших этапов инвазии, демонстрируя процедуру, будет проведен аспирантом Рахима из моей лаборатории. Все этапы этого протокола должны выполняться в стерильных условиях в вытяжке для культуры тканей.

Система Xcel, используемая для этого эксперимента, постоянно хранится в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, предназначенном исключительно для этого прибора при его первом использовании. Инструмент следует оставить в инкубаторе не менее чем на 16 часов, чтобы он выровнялся в соответствии с новой температурой и влажностью окружающей среды. Затем приготовьте Thout EPL 16, покрыв его 0,1% желатином в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия.

После того, как тарелка будет покрыта, промойте ее один раз PBS. Затем добавьте 100 микролитров восстановленной э г две среды, чтобы выполнить пустое считывание. Для измерения фонового импеданса при отсутствии ячеек.

Поместите EPL в систему агентов Excel на компьютере. Откройте программу агента Excel, щелкнув значок программы RTCA на рабочем столе в окне программы. Перейдите на вкладку «Макет» и выберите скважины, содержащие образцы.

Для программирования частоты сбора данных в режиме реального времени. Нажмите на вкладку расписания, затем нажмите на значок добавления шага с указанием количества показаний, а интервалы с указанием временного интервала между показаниями. Они автоматически устанавливаются на одну и 1.00 минуты соответственно.

Это программирует систему на выполнение фонового чтения. Нажмите на кнопку «Добавить шаг» и введите 300 в поле развертки и 10 минут в поле интервалов. Это запрограммирует прибор на выполнение измерений импеданса в течение 50 часов.

Чтобы начать эксперимент, нажмите на значок «Начать шаг». Фоновое сопротивление каждой скважины будет измеряться после проведения фонового измерения. В окне отобразится сообщение.

Готовы к следующему шагу, пожалуйста, нажмите. Следующий шаг для начала. В это время можно добавлять ячейки и контролировать образование монослоя, как описано.

В следующем разделе используемая здесь пупочная вена человека, эндотелиальные клетки или ЖЭ культивируются в двух средах EGM, восстановленных с помощью набора EGM из двух пуль, содержащих добавки факторов роста, и 5% FBS клеток следует поддерживать в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в присутствии 5% углекислого газа. В день эксперимента проверьте беглость HUB E Под микроскопом клетки должны иметь низкое число пассажей, желательно не более шести и менее 75% Con Fluent для генерации оттенка, монослойного сбора клеток с помощью трипсина. После того, как клетки отделились от колбы, все следы трипсина должны быть удалены центрифугированием при 200 G. После отжима промойте клетки одним раз PBS.

Затем повторно суспендировали клетки и восстановили e GM в двух средах до концентрации 2,5 умх на 10 до пятой клетки на миллилитр. Как только элементы будут ресуспендированы, удалите фоновую калибровку EPL из системы EXOGEN и добавьте 100 микролитров суспензии HX к 100 микролитрам E GM двух уже имеющихся в пластине средах. Немедленно поместите ЭПЛ в анализатор клеток системы Excel.

Начните сбор данных об импедансе, нажав кнопку «Начать шаг» в окне программного обеспечения. Дайте эндотелиальным клеткам расти. Система будет продолжать снимать показания импеданса каждые 10 минут.

У них наблюдается характерное переходное уплощение клеточного индекса через четыре-шесть часов после посева, за которым следует еще одна стабилизация через 16-18 часов. Следовательно, важно дать клеткам образовать сливающийся монослой в течение как минимум 18 часов. После того, как монослой сформировался, пришло время добавить вторгшиеся клетки для подготовки к анализу на инвазию.

Подготовьте вторгшиеся опухолевые клетки. Здесь используются клетки остеосаркомы. Начните с забора клеток трипсином.

Удалите все следы трипсина, открутив клетки при 200 G и промыв один раз PPS. После промывки реуса суспензируйте клетки до тех пор, пока конечная плотность не составит от 10 до 10 до пятой части на миллилитр в среде, используемой для выращивания опухолевых клеток, такой как RPMI или среда DMEA, содержащая 10% FBS. Приостановите эксперимент, щелкнув значок шага паузы в окне программного обеспечения.

Снимите EPL и аспирируйте EGM в двух средах из вакуумного монослоя. Добавьте 100 микролитров суспензии опухолевых клеток, содержащей один умно-10 на четвертую клетку. Как правило, соотношение 1 к 2,5 опухолевым клеткам к эндотелиальным клеткам является наиболее подходящим для анализа.

Тем не менее, соотношение может быть оптимизировано для отдельных клеточных линий. Поместите ЭПЛ обратно в агентурную систему Excel в инкубаторе. Нажмите на шаг «Продолжить», чтобы продолжить снятие показаний импеданса с интервалом в 10 минут.

Отслеживайте вторжение в режиме реального времени в течение следующих 6–12 часов. Падение клеточного индекса происходит в результате ретракции эндотелиальных соединений и проникновения вторгшихся опухолевых клеток. Когда эксперимент будет завершен, используйте программное обеспечение для экзергена, чтобы нормализовать результаты до момента добавления вторгшихся опухолевых клеток.

Программное обеспечение для эксергена позволяет нормализовать с любой временной точки времени VEX культивировались в системе эксергена, как показано в этом видео, и после формирования монослоя добавлялись либо K 7 M two, либо K 12 клеток. Как показано на рисунке, резкое снижение клеточного индекса происходит в течение нескольких часов после введения К семь М двух клеток. K seven M two — это клеточная линия остеосаркомы с высоким уровнем метастатического развития.

Эти клетки экспрессируют высокий уровень белка цитоскелетного линкера ene, что объясняет инвазивные свойства клеточной линии. Клетки К-12, с другой стороны, менее метастатически и не способны проникать через эндотелиальный монослой так же эффективно, как клетки К-7-М-2. Это представлено менее глубоким снижением клеточного индекса, как показано здесь.

Показанный здесь элемент управления представляет собой импеданс монослоя uve. При отсутствии раковых клеток эксперименты проводились в трех экземплярах. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерить инвазию в режиме реального времени, создавая монослой эндотелиальных клеток и воздействуя на монослой раковыми клетками.

Начальные этапы эксперимента по формированию монослоя HU XL могут быть использованы для оценки пролиферации клеток по импедансу. Два.