В режиме реального времени Электрические характеристики Сопротивление техника выполнения измерить Вторжение клеточный монослой эндотелиальных раковыми клетками

В данном видео демонстрируется метод мониторинга инвазии монослоя эндотелиальных клеток раковыми клетками с использованием метода электрического импеданса в режиме реального времени. Сначала эндотелиальные клетки пупочной вены человека (VE) высевают в 16-луночные планшеты EPL, дно лунок которых покрыто золотыми электродами. Для создания сплошного монослоя добавляют раковые клетки, которые прикрепляются к VE и инвазируют монослой HVAC, разрушая контакты между эндотелиальными клетками. Затем регистрируют показатели импеданса, которые зависят от общей площади дна лунки, покрытой клетками.

Степень инвазии затем может быть определена на основании изменений электрического импеданса. Основное преимущество данного метода перед существующими способами, такими как анализы с использованием пустотной камеры или METROGEL, заключается в том, что взаимодействия между эндотелиальными и опухолевыми клетками более точно имитируют метастатический процесс in vivo, а данные получаются в режиме реального времени и легче поддаются количественному анализу по сравнению с конечным анализом в других методах. Таким образом, данный метод позволяет получить представление о механизмах инвазии раковых клеток.

Этот метод также может быть применен к другим системам, например, для исследования межклеточных взаимодействий в иммунной системе. Кроме того, начальный этап эксперимента, в ходе которого наблюдается рост клеток UX, может быть использован для оценки пролиферации любой клеточной линии без дальнейших этапов инвазии; процедуру продемонстрирует аспирант моей лаборатории Сайд Рахим. Все этапы данного протокола должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном шкафу для культивирования тканей.

Система Xcel, используемая в данном эксперименте, постоянно содержится в инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide, который при первом использовании прибора выделен исключительно для этого оборудования. Прибор следует оставить в инкубаторе минимум на 16 часов для уравновешивания с новой температурой и влажностью среды. Затем подготовьте Thence EPL 16, покрыв его 0,1% gelatin на один час при 37 °C.

После нанесения покрытия промойте планшет один раз PBS. Затем добавьте 100 µL восстановленной среды e gm two для проведения холостого измерения, чтобы измерить фоновый импеданс в отсутствие клеток.

Поместите EPL в систему Excel agent на компьютере. Запустите программное обеспечение Excel agent, нажав на иконку ПО RTCA в окне программ на рабочем столе. Перейдите на вкладку «Layout» (Схема) и выберите лунки, содержащие образцы.

Чтобы запрограммировать частоту сбора данных в режиме реального времени, перейдите на вкладку schedule, затем нажмите на значок add a step. Параметр sweeps указывает количество измерений, а intervals — временной интервал между измерениями. По умолчанию эти значения установлены на 1 и 1.00 minute соответственно.

Эта настройка программирует систему на выполнение фонового считывания. Нажмите «добавить шаг» (add a step), введите 300 в поле «сканирования» (sweeps) и 10 минут в поле «интервалов» (intervals). Это позволит прибору выполнять измерения импеданса в течение до 50 часов.

Для начала эксперимента нажмите на иконку запуска шага. После проведения фонового измерения будет измерен фоновый импеданс каждой лунки. В окне отобразится соответствующее сообщение.

Для перехода к следующему шагу нажмите кнопку. Нажмите «Следующий шаг» для начала. На данном этапе можно добавить клетки и контролировать формирование монослоя согласно описанию.

В следующем разделе описывается культивирование использованных здесь эндотелиальных клеток пупочной вены человека или HUVEC в среде EGM-2, приготовленной с помощью набора добавок EGM-2, содержащего факторы роста, и 5% FBS. Клетки следует содержать в инкубаторе при температуре 37 °C в атмосфере 5% CO2. В день эксперимента под микроскопом проверьте степень конфлюэнтности HUVEC. Клетки должны иметь низкий номер пассажа, желательно не более шести, и быть конфлюэнтными менее чем на 75%. Для получения монослоя HUVEC соберите клетки с помощью трипсина. После открепления клеток от флакона все следы трипсина следует удалить путем центрифугирования при 200 ×g. После центрифугирования однократно промойте клетки раствором PBS.

Затем ресуспендируйте клетки и реконструированную среду E GM two до концентрации 2,5 × 10⁵ клеток на мл. После ресуспендирования клеток извлеките из системы EXOGEN калиброванный EPL с фоновым сигналом и добавьте 100 µL суспензии HX к 100 µL среды E GM two, уже находящейся в планшете. Немедленно поместите EPL в анализатор клеток системы Excel.

Начните сбор данных об импедансе, нажав кнопку запуска шага в окне программного обеспечения. Дайте эндотелиальным клеткам вырасти. Система будет продолжать снимать показатели импеданса каждые 10 минут.

Uve демонстрируют характерное временное выравнивание индекса клеток через четыре-шесть часов после посева, за которым следует еще одна стабилизация через 16–18 часов. Следовательно, важно дать клеткам сформировать сплошной монослой в течение как минимум 18 часов. После того как монослой сформируется, можно добавлять инвазивные клетки для подготовки к анализу инвазии.

Подготовьте инвазивные опухолевые клетки. В данном случае используются клетки остеосаркомы. Начните со сбора клеток с помощью трипсина.

Удалите все следы трипсина, центрифугируя клетки при 200 G и один раз промыв их раствором PPS. После завершения промывки ресуспендируйте клетки до конечной плотности 1 × 10⁵ клеток/мл в среде, использовавшейся для выращивания опухолевых клеток, например, в среде RPMI или DMEM, содержащей 10% FBS. Приостановите эксперимент, нажав значок паузы в окне программы.

Удалите EPL и аспирируйте среду EGM two из монослоя VAC. Добавьте 100 µL суспензии опухолевых клеток, содержащей 1 × 10⁴ клеток. Как правило, для данного анализа наилучшим образом подходит соотношение опухолевых клеток к эндотелиальным клеткам 1:2,5.

Тем не менее, данное соотношение можно оптимизировать для отдельных клеточных линий. Поместите EPL обратно в систему Excel agent в инкубатор. Нажмите кнопку продолжения шага, чтобы продолжить снятие показателей импеданса с интервалом в 10 минут.

Наблюдайте за процессом инвазии в режиме реального времени в течение следующих 6–12 часов. Снижение клеточного индекса будет следствием разрыва эндотелиальных соединений и проникновения инвазивных опухолевых клеток. По завершении эксперимента используйте программное обеспечение Exergen для нормализации результатов относительно момента добавления инвазивных опухолевых клеток.

Программное обеспечение exergen позволяет проводить нормализацию по любой временной точке, в течение которой VEX культивировались в системе exergen, как показано в данном видео; при этом после формирования монослоя были добавлены либо клетки K seven M two, либо клетки K 12. Как видно здесь, через несколько часов после введения клеток K seven M two наблюдается резкое снижение индекса клеток. K seven M two представляет собой высокометастатическую линию клеток остеосаркомы.

Эти клетки экспрессируют высокие уровни цитоскелетного линкерного белка ene, что обуславливает инвазивные свойства данной клеточной линии. Клетки K 12, напротив, менее метастатичны и не способны проникать через эндотелиальный монослой так же эффективно, как клетки K seven M two. Это проявляется в менее выраженном снижении индекса клеток, как показано здесь.

Представленный здесь контрольный образец отражает импеданс монослоя венульных эндотелиоцитов. В отсутствие раковых клеток эксперименты проводились в трех повторностях. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как измерять инвазию в режиме реального времени путем создания монослоя эндотелиальных клеток и последующего воздействия на этот монослой раковыми клетками.

Первоначальные этапы эксперимента, включающие формирование монослоя HU XL, могут быть использованы для оценки пролиферации клеток методом импеданса. Два.