Всего горы На месте Гибридизация E8.5 в E11.5 эмбрионов мыши

Общая цель этой процедуры заключается в определении паттернов экспрессии генов в эмбрионах целых мышей. Это достигается путем разработки и создания специфического рибозонда для интересующего гена гена. Далее эмбрионы собирают и обрабатывают для гибридизации.

Затем меченый зонд гибридизуется с эмбрионами. Заключительным этапом является визуализация гибридизованного зонда с помощью иммуногистохимического обнаружения. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают паттерны экспрессии генов в целых эмбрионах или эмбриональных срезах.

Как правило, люди, не знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что процедуры гибридизации в институте длительны и технически сложны, есть несколько важных этапов, которые в совокупности влияют на качество конечного результата. Во-первых, сгенерируйте матричную ДНК путем амплификации интересующей последовательности с использованием ген-специфичных ПЦР-праймеров, разработанных с использованием последовательностей промоторов транскрипции фаржа на пяти простых концах. Затем очистите продукт ПЦР и включите этап расщепления протеиназы К в соответствии с письменным протоколом.

Затем настройте реакцию транскрипции in vitro и оптимальную температуру в инкубаторе на два часа. После расщепления ДНК матрицы ДНК очистите рибозонд с помощью очистки колонки, оцените выход зонда с помощью NanoDrop или абсорбционного считывателя микропланшетов. Затем отрегулируйте концентрацию зонда до 100 нанограмм на микролитр в соответствии с расчетным выходом.

Затем проверьте качество зонда путем денатурации гель-электрофореза из акриламида, как указано в письменном протоколе, и, измерив удельную активность зонда RIBA, хороший зонд должен получить одну дискретную полосу на геле с минимальным мазком для измерения удельной активности, выполнить серийное разведение зонда ribo для получения диапазона разведений от 10 до минус двух до 10 до минус пяти. Затем пипеткой нанесите по одному микролитру каждого разведения на кусок мембраны с высокой степенью связи диаметром 82 мм вместе с одним микролитром немеченного образца ДНК в качестве контроля. Сшивайте фильтр немедленно в УФ-сшивающем агенте с давлением 125 миллиджоулей после сшивки.

Добавьте 10 миллилитров 1%-ного блокирующего реагента в однократный TN-буфер для инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут после завершения блокирования. Удалите блокирующий раствор и промойте фильтр в течение 15 минут при комнатной температуре в 10 миллилитрах одноразового TN-буфера во время промывки мембраны. Приготовьте 1 к 5 000 разбавлений анти-доксиген в фрагменте FAB в 10 миллилитрах одноразового TN-буфера после промывки.

Инкубируйте мембрану в этом растворе в течение 30 минут После инкубации промойте мембрану дважды по 15 минут каждый в 10 миллилитрах однократного TN-буфера. После окончательной промывки отсадите промывочный раствор из чашки Петри и замените его пятью миллилитрами фиолетового субстрата BM. Инкубируйте мембрану в этом растворе в течение 30 минут.

По прошествии 30 минут проверьте мембрану на наличие видимого сигнала, излучаемого из пятна, соответствующего разведению от 10 до минус четырех. Если сигнал виден, остановите цветовую реакцию, промыв пятикратным TE дважды в течение пяти минут каждый раз. Если в течение 30 минут сигнал не виден, зонд следует выбросить.

Соберите эмбрионы мышей в ледяной PBST. Затем отсортируйте эмбрионы по генотипу в четырехмиллилитровые винтовые папки, содержащие PBST. Закрепите эмбрионы 4% ПАРАЛЬДЕГИДОМ в PBST, если не указано иное.

Все этапы инкубации и промывки производятся растворами, залитыми до нижнего уровня горлышка флакона, объем которого составляет около четырех миллилитров. Оставьте эмбрионы на ночь при температуре четыре градуса Цельсия после фиксации. Аспирируйте 4%-ный паральдегид в PBST с помощью стеклянной пипетки для пасты и замените PBST.

Поместите флакон на лед на пять минут для мытья. Повторите этот процесс, чтобы промыть салфетку во второй раз. Затем аспирируйте PBST и обезвоживайте эмбрионы поэтапно с помощью метанола серии PBST до 100% метанола.

Обратите внимание, что наконечник пипетки находится на противоположной стороне флакона, чтобы избежать повреждения эмбрионов, при желании эмбрионы могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия в 100% метаноле до восьми месяцев и, возможно, дольше до использования. Перенесите эмбрионы в чашку, проколите сердце и голову эмбрионов E 10.5 и старше ножом для микродиссекции, пока эмбрионы еще находятся в метаноле. Это позволяет растворам для мытья проникать в желудочки мозга и камеры сердца и снижает фоновое окрашивание.

Затем регидратируйте эмбрионы путем последовательных промываний в метаноле серии PBST. В завершение двумя промывками по пять минут каждая в 100% PBST отбеливают эмбрионы, готовя раствор из четырех частей PBST на одну часть 30% перекиси водорода и инкубируя эмбрионы в этом растворе в течение одного часа на льду. Во время инкубации поместите свежеприготовленный буфер для гибридизации при температуре 65 градусов Цельсия для предварительного нагрева.

Промойте эмбрионы PBST дважды по пять минут каждый. Во время окончательной промывки приготовьте бульон протеиназы K в количестве 20 мг на миллилитр с водой DEPC. Затем серийно разводите бульон до 10 микрограмм на миллилитр.

Протеиназу К в ПБСТ отсасывают из конечного промывочного раствора и заменяют на один миллилитр из 10 мкг на миллилитр раствора протеиназы К. Поместите флакон вертикально в штатив для пробирок на водяной бане при температуре от 25 до 30 градусов Цельсия и инкубируйте от 10 до 30 минут, в зависимости от размера эмбрионов. Запишите время начала как оптимальное и воспроизводимое.

Время инкубации имеет решающее значение для обеспечения проникновения через зонд рибо без переваривания эмбриона. Чтобы остановить расщепление протеазы К, аспирируйте раствор протеиназы К за 30 секунд до истечения времени инкубации. Затем, когда время инкубации истечет, добавьте свежеприготовленный глицин в два миллиграмма на миллилитр в PBST.

Повыдерживаем пять минут при комнатной температуре. Затем повторяйте промывание глицином еще пять минут. Затем дважды постирайте в PBST по пять минут каждый.

Затем восстановите протеиназу К, обработанные эмбрионами, погрузив эмбрионы в 4% PARALDEHYDE в PBST с добавлением 0,2% глутаральдегида на 20 минут. Затем промойте эмбрионы в PBST три раза по пять минут каждый. После последней промывки аспирируйте PBST и замените его одним миллилитром предварительно подогретого буфера для гибридизации.

Как только эмбрионы приживутся, аспирируйте буфер для гибридизации и замените его одним миллилитром свежей предварительно теплой гибридизации. Буфер. Инкубируйте флаконы вертикально в духовке с температурой 65 градусов Цельсия и встряхивающей платформой в течение одного часа. Приготовьте гибридизационный буфер, содержащий 0,5 мкг на миллилитр меченого рибо.

Зонд для эмбрионов до Е 8,5 или от 0,1 до одного микрограмма на миллилитр зонд для эмбрионов выше Е 8,5. После инкубации замените раствор предварительной гибридизации на 0,4 миллилитра этого раствора и гибридизируйте в течение ночи при температуре 65 градусов Цельсия. На следующий день проверьте качество эмбрионов.

Если эмбрионы были чрезмерно обработаны протеиназой К, они могут прилипнуть к размеру флакона, казаться чрезвычайно прозрачными или разваливаться. Эмбрионы, которые выглядят таким образом, должны быть отбракованы, так как их дальнейшая обработка не приведет к получению интерпретируемых данных. Замените буфер для гибридизации четырьмя миллилитрами раствора.

Один при температуре 70 градусов по Цельсию. Поддерживайте эту температуру и дважды по 30 минут каждый для эмбрионов Е 8,5 или три раза по 30 минут на промывку. Для эмбрионов Е 9,5 и старше во время последней промывки приготовьте четыре миллилитра 50%-ного раствора, по одному 50%-ному раствору по два на каждый флакон и предварительно подогрейте до 70 градусов Цельсия после последней стирки.

Инкубируйте зародыши в этом растворе в течение 10 минут, затем промойте три раза по пять минут за одну промывку четырьмя миллилитрами раствора. Два при комнатной температуре с укачиванием после стирки. Замените раствор на свежий.

Два препарата, содержащие 100 микрограммов на миллилитр РНК А и 100 единиц на миллилитр РНК Т, один инкубируют при 37 градусах Цельсия два раза в течение 30 минут за промывку. Далее моющий раствор три при 65 градусах Цельсия с покачиванием два раза по 30 минут каждая стирка для Е 8,5, три раза по 30 минут на стирку для Е 9,5 и старше. Наконец, постирайте три раза по пять минут за одну стирку с одним TBST.

Затем приступают к выявлению антител. Отсадите окончательную TBST из флакона и замените 0,5 миллилитра одного раза TBST плюс 10% термически обработанной овечьей сыворотки. Поместите флакон вертикально на шейкер при комнатной температуре и инкубируйте с покачиванием не менее двух с половиной часов, чтобы блокировать сайты связывания неспецифических антител.

По истечении времени инкубации аспирируйте блокирующий раствор и замените его свежей однократной TBST плюс 10% сыворотка, содержащей от 1 до 2000 до 1 до 5000 разведения вычтенной щелочной фосфатазы, конъюгированный овечий антиген и антитела к фрагментам FAB, и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Стирайте три раза по пять минут каждый раз с одним TBST. Затем пять-шесть раз в течение одного часа достичь комнатной температуры и, наконец, на ночь при четырех градусах Цельсия удалить избыток антител.

На следующий день. Промойте эмбрионы дважды в течение 20 минут за промывку свежеприготовленным буфером щелочной фосфатазы. Это важная процедура для уменьшения фона.

Замените последнюю промывку одним миллилитром предварительно прогретой подложки BM purple AP. Инкубируйте при комнатной температуре в защищенном от света месте и периодически отслеживайте сигнал с помощью препарирующего микроскопа. Для обильного мессенджера.

РНК должна быть видна в течение 15 минут. Когда сигнал хорошо виден или если окрашивание фона начинает вызывать проблемы, остановите реакцию, промыв дважды в течение пяти минут за промывку одним снимком PBST плюс пять миллимолярных снимков EDTA, чтобы задокументировать характер окрашивания всего эмбриона монтировки. Как только это будет сделано, верните эмбрионы во флакон с фиолетовым субстратом BM и инкубируйте в течение 16-24 часов при комнатной температуре, пока внешняя поверхность эмбриона не станет темно-синей, чтобы позволить пятну проникнуть по всему эмбриону.

Затем перенесите эмбрионы в 4%-ную пармальную шкуру в PBST для фиксации на несколько часов или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Этот заключительный этап фиксации имеет решающее значение для долгосрочного сохранения рисунка окрашивания. Наконец, приступайте к парафину, заделке и секции в соответствии с процедурами, изложенными в письменном протоколе, чтобы выявить это окрашивание.

На этом изображении показано успешное крепление отверстия в гибридизации C two эмбриона E 10.5 с использованием специфического рибозонда gata three. Вот изображение, показывающее эмбрион E 11.5, который был успешно помечен с помощью зонда Fox G one specific rbo. На этом изображении показан сильный фон и слабый сигнал от неудачной гибридизации в C two с частично деградировавшим зондом gata three, что иллюстрирует важность тщательного контроля качества зондов для обеспечения высокого качества результатов.

Вот изображение еще одной неудачной процедуры. В этом случае процедура проводилась без пункции головки, что приводило к высокому уровню фонового окрашивания в желудочках, о чем свидетельствуют наконечники стрелок. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить высококачественную гибридизацию в институте для определения паттернов экспрессии генов на эмбрионах мышей для пространственных деталей и сравнения временных или генотипов.