Частица Агглютинация Метод Полиовирус Идентификация

Общая цель следующей процедуры заключается в быстром выявлении изолятов вируса полиомиелита с помощью простого протокола. Для этого анализа мы используем сенсибилизированные частицы желатина, покрытые химерными молекулами, содержащими внеклеточный домен рецептора полиовируса человека, связанного с IgG two fc. Поскольку эти частицы обладают равномерным сродством ко всем серотипам изолятов полиовируса, агглютинация частиц происходит при инкубации с образцами, содержащими любой полиовирус человека.

Однако, если присутствуют антитела, способные распознавать специфический вирус, выделяющий образец, происходит нейтрализация и предотвращается агглютинация с помощью этой экспериментальной системы, быстрая идентификация изолятов полиовируса может быть выполнена в одну стадию реакции. Основным преимуществом данной методики существующего сосуда, как и обычного испытания на нейтрализацию, является простота процедуры SIM и интерпретации, направленная на снижение трудозатрат и ускорение, а также сокращение времени получения результатов. Чтобы восстановить антитела против ПВ один, ПВ 2 и ПВ 3, добавьте 0,5 миллилитра воды в каждый флакон

Затем переложите каждый раствор антитела в отдельные пробирки, содержащие 4,5 миллилитра поддерживающей среды. Некоторые партии анти-ПВ антител поставляются в восстановленной форме для таких партий анти-ПВ антител. Добавлять воду для восстановления не нужно.

Далее приготовьте индивидуальные смеси комбинированного раствора антител с конечным объемом 3,6 миллилитра в свежих пробирках с маркировкой. Например, смешайте 1,8 миллилитра анти-ПВ 1 с 1,8 миллилитрами анти-ПВ 2. Чтобы получить комбинацию анти-PV один плюс PV-два, повторите это для каждой возможной парной комбинации, а также приготовьте раствор, содержащий все три типа антител, смешав вместе по 1,2 миллилитров каждой антисыворотки.

После четырех смесей были изготовлены по 720 мкл FCS к каждому раствору антитела. Это поможет снизить неспецифическую агглютинацию частиц желатина антителами во время проведения анализа. Пулы антител могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут использованы в анализе агглютинации.

В этом анализе мы используем лиофилизированные частицы желатина, покрытые внеклеточными доменами рецептора полиовируса человека и двумя FC-доменами IgG. Обязательно используйте одну партию частиц, а не разные партии в одном эксперименте, чтобы обеспечить постоянство изображения агглютинации для восстановления частиц в 1,5 миллилитрах восстанавливающего буфера на каждый флакон. Легкими постукивающими движениями хорошо перемешайте.

Восстановленные частицы могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до двух недель. Во-первых, спланируйте свой эксперимент на 96-луночном микротитровом планшете. Для каждого образца номер один будет содержать только вирус.

Лунки со второго по пятый будут содержать вирус плюс один из четырех растворов смешанных антител. Обязательно сохраните одну лунку для отрицательного контроля, содержащую только среды без вирусов или антител. После того, как планшет будет установлен, добавьте по 12 микролитров правильного раствора антител в каждую лунку со второго по пятый ряды и 12 микролитров роста.

Средний уровень только для вируса, лунки в первом ряду, и для отрицательного контроля в шестом ряду. Далее добавьте 12 микролитров образца вируса в первые пять рядов и 12 микролитров питательной среды в отрицательную контрольную лунку в шестом ряду. После того, как антитела и вирус будут покрыты, восстановите восстановленные частицы желатина, осторожно постукивая по ним, и немедленно добавьте 25 микролитров частиц на лунку во все лунки.

Важно не дать частицам осесть перед переносом их на пластину, чтобы получить равное количество частиц в каждой. Хорошо поместите пробирную пластину на тарелочный миксер и перемешивайте в течение 30 секунд. Затем поместите пластину на лист белой бумаги и выдержите пластину при комнатной температуре в течение двух часов, чтобы произошла агглютинация.

Важно не перемещать планшет ни в коем случае во время или после инкубации, так как образовавшаяся агглютинация нестабильна. После того, как реакция произошла, сделайте несколько снимков пластины, на которых можно оценить качество агглютинации в каждой лунке. В лунках, где агглютинация не произошла, как показано здесь слева, цветные частицы желатина будут осаждаться на дне лунки в лунках, где произошла агглютинация.

Из-за взаимодействия между вирусом и pvr, IgG двумя покрытыми А желатиновыми частицами, виден диффузный цветной рисунок, как показано в центре. В этом эксперименте мы проверили способность вирусных растворов, ПВ один, два и три, индуцировать GLU в присутствии антитела. Комбинации обозначены, как показано здесь, при отсутствии вируса или антител агглютинация не происходит, а частицы желатина выпадают в осадок в контрасте с хорошо содержащим вирусом, но без антител.

Агглютинация произошла из-за взаимодействия вируса. С помощью PVR IgG, покрытых двумя частицами А желатина в экспериментальных лунках, предотвращается перенасыщение вирусов в любой лунке, содержащей антитела, которые специфически нейтрализуют этот вирус. Например, избыток нации полиовируса первого типа предотвращается в лунках, содержащих антитела против ПВ один, но не в лунках, содержащих только антитела против ПВ 2 и против ВП 3.

То же самое относится и ко второму и третьему типам полиовируса. Пока вы мастерите, эту технику можно освоить всего за три часа, если она выполнена правильно.