Лазерной абляции предпочки данио рерио по изучению почечных эпителиальных Регенерация

Общая цель данной процедуры заключается в проведении направленного мечения клеток почек в эмбриональной почке данио-рерио (пронефросе) для изучения регенерации почечного эпителия после острого повреждения почек. Это достигается путем микроинъекции эмбрионов данио-рерио конъюгата декстрана с флуоресцентным красителем. В ходе инкубации в течение ночи конъюгаты селективно поглощаются клетками проксимальных канальцев нефронов.

На следующий день клетки исследуют с помощью эпифлуоресцентной микроскопии, и выбранные клетки аблируют с использованием импульсной лазерной системы. Впоследствии морфологические и молекулярные изменения оценивают с помощью гистологии, гибридизации C two на целых препаратах и иммуногистохимии. Основным преимуществом этого метода перед существующими способами, такими как моделирование острого повреждения почек с помощью нефротоксического антибиотика гентамицина, является то, что подобные воздействия вызывают катастрофические повреждения и приводят к летальному исходу, что делает невозможным анализ процессов регенерации почек с течением времени.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования почек, такие как идентификация молекулярных сигнальных событий, происходящих в процессе регенерации эпителия. Идея этой методики возникла у нас, когда мы захотели разработать детальный анализ регенерации почечного эпителия в чашках Петри. Соберите оплодотворенные эмбрионы zebrafish в модифицированном растворе E 3 без метиленового синего.

Выращивайте оплодотворенные эмбрионы при температуре 28.5 °C до достижения возраста от 48 до 55 часов после оплодотворения, когда почечная система эмбриона начнет функционировать. Перед началом инъекций подготовьте систему для инъекций с использованием формы с треугольными углублениями для фиксации эмбрионов. Затем подготовьте стандартные иглы для микроинъекций и раствор для маркировки проксимальных канальцев. Начните эксперимент с подготовки эмбрионов.

Сначала с помощью тонкого пинцета удалите Corian из всех невылупившихся яиц. Затем промойте остатки Corian, очистите чашку Петри от мусора и залейте в нее 30 milliliters модифицированного раствора E three. Затем анестезируйте личинок пятью миллилитрами trica.

Убедитесь, что личинки полностью анестезированы, проверив реакцию на прикосновение. Если анестезия недостаточна, при инъекции личинки будут дергаться. В-третьих, с помощью пластической переносной пипетки поместите личинок в форму.

Расположите животных так, чтобы их головы находились в самой глубокой части углубления, а туловища — вдоль стенки лунки. Далее приступайте к внутримышечным микроинъекциям: наберите в подготовленную иглу от двух до трех µL флуоресцеинового декстрана, установите иглу и введите приблизительно 1 nL раствора в соматическую часть каждого животного. Конъюгаты декстрана легко эндоцитируются проксимальными канальцами нефрона, что позволяет проводить преимущественное мечение данной популяции эпителиальных клеток.

Цельтесь в верхнюю часть сомита и избегайте области желточного мешка, иначе нефронные канальцы будут повреждены, как в случае с этим неправильно инъецированным животным. После инъекции перенесите личинок в чистую чашку Петри и трижды промойте их свежей средой E3, чтобы удалить все следы трикаина. Затем накройте крышку фольгой и инкубируйте животных в течение ночи при температуре 28 °C.

Перед началом данной процедуры приготовьте среду для иммобилизации; часть аликвот оставьте при комнатной температуре для немедленного использования, а остальные храните при температуре четыре градуса Цельсия для длительного хранения. Начните с анестезии личинок zebrafish с использованием пяти миллилитров трикаина в 30 миллилитрах E3. Как и прежде, убедитесь, что рыбы не реагируют на тактильные раздражители.

Теперь осмотрите инъецированных животных под флуоресцентным микроскопом, чтобы отобрать личинок с четко визуализируемыми проксимальными канальцами. Перенесите до 12 личинок в новую чашку с той же концентрацией trica, используя составной флуоресцентный микроскоп, оснащенный фильтром fitzy, освещением в светлом поле и лазером. Процедура абляции начинается с переноса и анестезии личинок в чашку со средой для иммобилизации.

Подождите две минуты, затем перенесите личинку на предметное стекло с углублением, содержащее каплю иммобилизирующей среды. С помощью тонкого зонда осторожно расположите животное спинкой вверх и сфокусируйтесь на дорсальной стороне. Теперь, используя калиброванную импульсную лазерную микроточечную систему, аблируйте один из нефронов, оставив другой нетронутым в качестве контроля.

Вы заметите рассеивание флуоресценции по мере абляции эпителиальных клеток почек. Затем аккуратно перенесите животное в лунку 12-луночного планшета и трижды промойте его в среде E3, чтобы удалить метилцеллюлозу. Продолжайте абляцию нефронов, пока первый 12-луночный планшет не будет заполнен.

Затем проведите анестезию еще 12 животных и повторите процедуру. Для преимущественного мечения проксимальных канальцев ввели Dextra Fitzy. Через три дня после оплодотворения в нефроне каждого животного была выполнена лазерная абляция.

Спустя один день после абляции. Через четыре дня после абляции регенерация не выражена, однако регенерация произошла после абляции клеток in situ два. Для анализа изменений в фиксированных образцах в отдельные моменты времени использовалась гибридизация.

Этот эмбрион не подвергался абляции. В отличие от него, у этого эмбриона была удалена большая часть трубчатого эпителия, а у этого — короткий участок трубчатого эпителия. После этой процедуры можно применить другие методы, такие как гибридизация in situ на целом препарате, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, об изменениях в экспрессии генов в процессе регенерации нефрона.

Не забывайте, что работа с химическими веществами может быть крайне опасной. Во время данной процедуры рекомендуется соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты, например, лабораторного халата и перчаток.