Метод Роман противоракового препарата развитию опухоли использованием эксплантатов хирургической Образцы
29 июля 2011 г.
Здесь мы создали метод для тестирования на наркотики эффективности с хирургической образцов опухолей головного мозга, называемый "метод эксплантатов опухоли". С помощью этого метода мы можем оценить эффективность препарата, не нарушая микроокружение солидных опухолей. Для проверки надежности этого метода, мы описываем репрезентативные данные с нашими глиомы образца получавших текущий первой линии химиотерапевтического агента, темозоломида.
Общая цель данной процедуры заключается в разработке нового метода тестирования эффективности лекарственных препаратов с использованием хирургических образцов опухолей головного мозга, получившего название метод эксплантации опухоли X. Для этого сначала в ходе предоперационных экспериментов осуществляется забор свежеудаленных хирургических образцов злокачественных глиом во время операции. Затем образцы транспортируются в центр заготовки тканей для их разделения на части, предназначенные для клинической диагностики и научно-исследовательских целей.
Затем в исследовательской лаборатории эксплантаты опухоли разделяют на несколько более мелких фрагментов ткани и переносят в оптимизированную среду. В завершение проводят внутриопухолевые инъекции препаратов-кандидатов, после чего эксплантаты инкубируют в течение 16 часов. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие эффективность лечения, с помощью окрашивания гематилином и эозином, а также иммуногистохимического анализа со специфическими маркерами типов клеток.
Мы также можем оценить эффективность препаратов in vitro с помощью проточной цитометрии и анализа формирования нейросфер. Большинство современных методов оценки эффективности препаратов оставляют разрыв между результатами в текущих доклинических экспериментальных моделях и эффективностью при лечении пациентов. В частности, при тестировании потенциальных лекарственных средств на солидных опухолях, таких как злокачественные глиомы, нельзя недооценивать межклеточный, а также внутриклеточный сигнальный обмен.
Чтобы избежать нарушения микроокружения солидных опухолей, мы разработали метод культивирования с использованием эксплантатов опухолей. После удаления опухолей у пациентов образцы передаются в отдел патоморфологии или из него. Мы разделяем фрагменты опухоли на две части. Образец опухоли из одной части используется для замороженных срезов и парафиновой заливки для клинической диагностики, а остальная часть опухолевой ткани направляется в исследовательские лаборатории для использования учеными.
С помощью данного метода можно сохранить микроокружение опухоли с прилежащими эндотелиальными и иммунными клетками опухоли, а также нормальными клетками головного мозга, которые либо окружают опухоль, либо мигрируют в ее полости. Перед обработкой ткани глиобластомы подготовьте жидкий раствор, среду и раствор агара. Смешайте их в соотношении один к одному.
Затем добавьте по 1 mL в каждую лунку 6-луночного планшета. После получения свежей ткани мультиформной глиобластомы перенесите ее в чашку Петри с помощью пинцета и осторожно промойте трижды по 5 mL ледяного 1× PBS, используя скальпель и пинцет. Из препарированных образцов вырежьте серийные срезы диаметром около 10 мм для создания опухолевых блоков; перенесите каждый блок в отдельную лунку 6-луночного планшета с агаровой средой, обеспечив достаточный доступ воздуха для поддержания жизнеспособности ткани.
Затем с помощью инсулинового шприца объемом 1 мл и иглы калибра 28G длиной 1/2 дюйма трижды введите в блоки опухоли 5% DMSO, 2,5 нМ темозоломида или новый кандидат в противоопухолевые препараты и инкубируйте в течение 16 часов при 37 °C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. После инкубации трижды промойте блоки 5 мл 1× PBS. Затем в пробирках объемом 50 мл зафиксируйте блоки, добавив 10 мл 10% (об/об) формалина на 24 часа.
Залейте ткань парафином и сделайте срезы толщиной четыре микрона, затем проведите депарафинизацию и регидратацию срезов. Поместите предметные стекла в штатив и инкубируйте их в следующих растворах. Ксилол трижды по пять минут.
100% этанолом трижды по пять минут. 95% этанолом один раз в течение пяти минут и 70% этанолом один раз в течение пяти минут. В завершение промойте под проточной водой в течение трех минут.
Подробную информацию о демаскировке антигенов и ингибировании эндогенной пероксидазы см. в прилагаемом письменном протоколе. Для блокировки срезов покройте ткани 10% нормальной сывороткой козы, перенесите предметные стекла во влажную камеру и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте стекла трижды в 1× PBS по пять минут за каждую процедуру.
Затем добавьте первичные антитела, такие как специфичные к человеку caspase three или KI 67, разведенные в 1× PBS, и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. На следующий день промойте предметные стекла в 1× PBS 3 раза по 10 минут. Затем нанесите на ткани две-три капли вторичных антител, меченных HRP.
Поместите предметные стекла во влажную камеру и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте стекла в PBS 3 раза по пять минут. Проявите образцы, используя набор хромогена DAB, следуя инструкциям производителя, и проведите докрашивание ядер.
Погрузите предметные стекла в гематин на 10–15 секунд. Затем промойте их под проточной водопроводной водой в течение трех минут. Обезводьте образцы, последовательно погружая стекла в следующие растворы, после чего нанесите закрепляющий реагент и накройте покровным стеклом.
Затем используйте флуоресцентный микроскоп для получения изображений предметных стекол. На данном рисунке Т1-взвешенное МРТ-изображение с усилением гадолинием демонстрирует выраженную глиобластому (GBM) в правой лобной доле пациента до операции. Послеоперационное изображение подтвердило субтотальное удаление новообразования.
Окрашивание гематилином и эозином демонстрирует наличие некроза, псевдопалисадообразных клеток и микрососудистой пролиферации. Таким образом, данные опухоли были гистопатологически диагностированы как GBM, чтобы проверить, могут ли образцы эксплантатов этих опухолей быть надежно использованы. Для проведения теста по определению эффективности лекарственного препарата мы исследовали действие темозоломида или TMZ; иммуногистохимический анализ тканей GBM, обработанных TMZ, демонстрирует существенное снижение количества KI 67-положительных опухолевых клеток по сравнению с контрольными образцами.
В свою очередь, иммуногистохимический анализ с использованием маркера апоптоза каспазы-3 не выявил значимых различий между образцами глиомы, обработанными TMZ, и контрольными образцами. Эффект терапии темозоломидом может быть дополнительно охарактеризован путем сочетания этого анализа ex explan с культивированием in vitro или проточной цитометрией. Мы можем сравнить данный метод ex explan с ксенотрансплантацией и анализом по формированию сфер in vitro для скрининга новых противоопухолевых препаратов.
После получения тканей опухоли в лаборатории процедуру данного эксперимента можно завершить в течение одного часа. Этот новый метод анализа относительно прост в исполнении и воспроизводим после диссоциации обработанных опухолевых имплантатов. Его можно сочетать с экспериментами in vitro.
Основным преимуществом данного анализа является сохранение микроокружения опухоли. Мы получили положительные данные на эксплантатах опухолей, подвергнутых воздействию Temodar, которые соответствовали результатам тех же пациентов, получавших лечение Temodar после хирургических операций. Наконец, этот метод применим и к другим солидным ракам, а следовательно, может ускорить поиск новых химиотерапевтических средств для лечения солидных опухолей.
Обзор
В данном исследовании представлен новый метод тестирования эффективности лекарственных препаратов с использованием хирургических образцов опухолей головного мозга, называемый методом эксплантации опухоли. Этот подход позволяет оценить эффективность препаратов, сохраняя при этом микроокружение опухоли.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Фармакология
Теоретические основы
- Современные методы анализа эффективности лекарственных средств часто не позволяют устранить разрыв между доклиническими моделями и результатами лечения пациентов.
- Солидные опухоли, такие как злокачественные глиомы, требуют тщательного учета межклеточных сигнальных взаимодействий.
- Сохранение микроокружения опухоли имеет решающее значение для точного тестирования препаратов.
- Метод эксплантации опухоли позволяет сохранить прилегающие опухолевые и нормальные клетки головного мозга.
Цель исследования
- Разработать надежный метод тестирования эффективности лекарственных препаратов при лечении опухолей головного мозга.
- Валидировать метод эксплантации опухоли, используя образцы глиомы, обработанные темозоломидом.
- Оценить влияние лекарственной терапии при сохранении микроокружения опухоли.
Используемые методы
- Свежеизвлеченные хирургические образцы злокачественных глиом были получены в ходе операции.
- Эксплантаты опухоли препарировали и инкубировали с кандидатными препаратами.
- Эффективность препаратов оценивали с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии.
- Для оценки эффектов терапии был проведен гистопатологический анализ.
Основные результаты
- Иммуногистохимический анализ показал снижение количества Ki-67-положительных опухолевых клеток после лечения темозоломидом.
- Значимых различий в маркерах апоптоза между обработанными образцами и контрольной группой не наблюдалось.
- Метод эксплантации опухоли продемонстрировал потенциал для надежного тестирования эффективности препаратов.
- Результаты могут быть сопоставлены с другими доклиническими моделями для дальнейшей валидации.
Выводы
- Метод эксплантации опухоли является перспективным подходом для тестирования эффективности препаратов при глиомах.
- Этот метод сохраняет микроокружение опухоли, что повышает значимость полученных результатов.
- Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации и валидации данного подхода для клинического применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Современные доклинические модели злокачественной глиомы часто не позволяют предсказать клиническую эффективность препаратов из-за утраты микроокружения опухоли in vitro и межвидовых различий при использовании ксенотрансплантатов. Метод эксплантации опухоли позволяет восполнить этот пробел за счет сохранения естественных взаимодействий между опухолью и стромой, что обеспечивает более физиологически релевантную оценку ответа на препараты. Данный подход способствует снижению механистических рисков и повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска онкологических лекарственных средств.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы за счет сохранения межклеточного и внутриклеточного сигнального обмена в нативной микросреде опухоли.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней с использованием свежеизвлеченных операционных образцов без артефактов, связанных с диссоциацией тканей.
- Прогностическая ценность: позволяет на ранних этапах оценивать эффективность, которая коррелирует с исходами у пациентов, что подтверждается снижением пролиферации Ki-67 в эксплантах, обработанных TMZ, что соответствует клиническим ответам.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные гистопатологические и иммуногистохимические данные (например, Ki-67, caspase-3) для скрининга соединений в системе, релевантной для заболевания.
- Практическая ценность: стандартизирует подготовку тканей и доставку препаратов посредством внутриопухолевых инъекций, что повышает воспроизводимость результатов между партиями эксплантатов.
- Масштабируемость: совместимость с проточной цитометрией и анализами нейросфер обеспечивает возможность многопараметрического анализа для кампаний по поиску перспективных соединений-лидеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: Связующее звено между стадией открытия и доклинической валидацией за счет использования реальных образцов опухолей, полученных от пациентов, что повышает значимость результатов для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go).
- Механистическое снижение рисков: Позволяет оценивать влияние препарата на маркеры пролиферации и апоптоза в условиях сохранной архитектуры ткани, что снижает количество ложноположительных результатов, характерных для упрощенных моделей.
- Прогностическая достоверность: Обеспечивает возможность параллельного сравнения с ксенографтами и моделями in vitro для триангуляции истинной активности препарата.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод эксплантации опухоли является частью этапа ранних открытий, позволяя проверять гипотезы и идентифицировать перспективные соединения до перехода к ресурсозатратным доклиническим моделям.
- Открывательная биология: Способствует уточнению сигнальных путей и валидации мишеней за счет сохранения стромально-эпителиальных взаимодействий, имеющих критическое значение для биологии глиомы.
- Скрининг: Обеспечивает количественные показатели на основе гистологии, что позволяет проводить надежную оценку соединений в контексте трехмерной ткани.
- Аналитика: Предоставляет мультиплексные данные (пролиферация, апоптоз, иммунная инфильтрация) с помощью иммуногистохимии и проточной цитометрии для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Используют образцы пациентов для сохранения релевантности заболевания, что поддерживает согласованность биомаркеров и преклиническую преемственность.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимую платформу для скрининга препаратов против солидных опухолей, адаптируемую под различных терапевтических кандидатов и различные учреждения.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет сохранения микроокружения опухоли, что повышает уверенность в мишени и прогностическую значимость.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам подготовки эксплантатов и инкубации с препаратами.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более обоснованный выбор в пользу продолжения или прекращения разработки (go/no-go), сокращая расхождения между доклинической и клинической эффективностью и снижая риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию противоопухолевых кандидатов с учетом рисков на основе ответов тканей человека.
Особенности внедрения
- Требуются навыки работы с нейрохирургическим материалом, гистопатологического окрашивания и иммуногистохимии.
- Зависит от доступа к свежим хирургическим образцам и скоординированного забора тканей с патологоанатомическими отделениями.
- Необходима стандартизированная подготовка среды, методы внутриопухолевого введения и контролируемые условия инкубации (37°C, 5% CO2).
- Требуется оптимизация для различных типов опухолей; необходима валидация для солидных раков, не являющихся глиомами, для обеспечения сохранности микроокружения.
- Ограничено окном жизнеспособности тканей после резекции, что требует быстрой обработки для сохранения целостности эксплантата.
