В естественных условиях Электропорация развивающихся Мышь Retina

Метод включения плазмидной ДНК в мышиных клеток сетчатки для целей осуществления любой выигрыш или потеря функции исследования

Общая цель этой процедуры заключается в проведении эксперимента по электропорации in vivo на неонатальных мышах с целью стабильного введения генетического материала в клетки сетчатки. Это достигается путем первой анестезии, когда новорожденная мышь прикладывается ко льду в течение примерно 5-10 минут. Вторым этапом процедуры является определение места соединения сросшихся век и вскрытие глаза путем разрезания вдоль этого соединения.

Затем в глазу делается разрез для облегчения введения шприца для микроинъекций. Затем через разрез вводится шприц для микроинъекций, и раствор ДНК вводится в субретинальное пространство. Наконец, на голову пациента помещается пинцетный электрод и подается серия электрических импульсов.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ретровирусная трансдукция, заключается в том, что электропорация in vivo не требует создания и обработки биологических агентов в качестве инструментов для доставки генов. В результате метод требует меньше труда, меньше реагентов и может проводиться на любой рабочей станции, одобренной для процедур на животных. Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, испытывают трудности, потому что требуется время и повторение, чтобы выработать чувство размещения микроинъекционного шприца в субретинальном пространстве.

Демонстрировать процедуру будет Джимми ДеМайло, постдокторант в моей лаборатории. Поскольку концентрация ДНК, необходимая для электропорации, относительно высока, желаемая плазмидная ДНК сначала амплифицируется недееспособными клетками, экстрагируемыми с помощью макси-препарата, а затем очищается и концентрируется примерно до пяти микрограммов на микролитр. В качестве инъекционного индикатора добавляется быстрый зеленый краситель FCF.

После того, как плазмидная ДНК была подготовлена, новорожденных мышей обезболили льдом в течение примерно пяти минут, наблюдая за ними до тех пор, пока потеря сознания не будет подтверждена компрессией подушечки ноги. Поменяйте местами область глаза, которую нужно ввести, с 70% спиртом профиля isop и используйте препарирующий микроскоп для определения соединительного эпителия FUS, где веки сходятся. С помощью острой иглы 30 калибра осторожно откройте глаз, разрезая вдоль сросшегося соединительного эпителия, не прикладывая чрезмерного давления вниз и не вырезая за пределы области века.

Как только веко будет открыто и глаз обнажен, с помощью кончика иглы сделайте небольшой разрез в склере рядом с соединением роговицы, стараясь не проникнуть слишком глубоко и не проколоть хрусталик. Введите иглу для инъекций с тупым концом в разрез. До тех пор, пока не будет ощущаться сопротивление противоположной склеральной стенки, медленно вводите 0,3 микролитра вязкого раствора ДНК в субретинальное пространство.

Стараясь не прижиматься слишком сильно к склеральной стенке, поворачивайте животное, чтобы проверить равномерное распределение раствора ДНК в сетчатке. Во-первых, замочите пинцет в PBS для максимизации электропроводности. Затем поместите голову инъецированного щенка между электродами так, чтобы введенный глаз примыкал к электроду с положительным полюсом, а неинъецированный глаз — к электроду с отрицательным полюсом.

Подайте пять квадратных импульсов с помощью генератора импульсов, каждый импульс имеет напряжение 80 вольт и длительность 50 миллисекунд с интервалом между импульсами 950 миллисекунд. Наконец, согрейте щенков под согревающей лампой, пока они не оправятся от ледяной анестезии. После выздоровления верните щенков с электропорацией к матери на третий день после рождения.

Большинство электропорированных клеток EGFP находятся в нейропластическом слое сетчатки и не демонстрируют отчетливых морфологических характеристик ни одной из дифференцированных нейронных глиальных клеток сетчатки. К 14-му дню после рождения электропорированные клетки могут быть обнаружены во внешнем и внутреннем ядерном слое сетчатки и в различных помеченных клетках. Теперь отображаются характерные морфологические признаки дифференцированных нейронов.

При попытке выполнить эту процедуру важно выполнить все шаги плавно и равномерно. Очень легко повредить сетчатку во время микроинъекции, и требуются упражнения для развития ловкости рук, необходимой для предотвращения повреждения тканей. Следуя этой процедуре.

Другие методы, такие как иммуногистохимия или гибридизация in situ, могут быть выполнены для того, чтобы определить, регулируется ли экспрессия генов, представляющих интерес, вверх или вниз в электросетчатке.