Бромдезоксиуридин (BrdU) Маркировка и последующих флуоресценции Активированный сотовый Сортировка по культуре независимой Определение растворенного органического углерода, разрушающих бактериопланктона

Микроорганизмы способствуют разложению многочисленных субстратов растворенного органического углерода или соединений DOC в таких средах, как водные экосистемы. Для полного понимания роли микробов в трансформации DOC необходима одновременная идентификация их таксономии и функций. В данном видео демонстрируется процедура таксономической идентификации свободноживущих бактерий или бактериального планктона, которые трансформируют специфические пулы DOC в водных средах.

Образцы воды, собранные из тестовой среды, обрабатывают и инкубируют с интересующим соединением и бромдезоксиуридином (BRDU), который встраивается в синтезируемую заново ДНК и активно растущие клетки. Затем бактериальный планктон, меченный BRDU, маркируют антителами к BRDU, конъюгированными с ZI. Бактериальный планктон с высоким уровнем мечения BRDU изолируют с помощью сортинга клеток с флуоресцентной активацией.

Затем из отсортированных клеток экстрагируют ДНК, и проводится таксономическая идентификация на основе результатов ПЦР-анализа гена 16 s рибосомальной РНК. Здравствуйте, меня зовут Стивен Роббинс, я из лаборатории доктора Чэнь Мао с кафедры биологических наук Университета Кент Стэйт. Сегодня мы с Лю продемонстрируем вам независимый от культивирования метод идентификации бактериального планктона, разлагающего растворенный органический углерод (DOC), в водных средах.

Основное преимущество данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как внесение питательных веществ с последующим анализом ДНК бактериального сообщества, заключается в том, что анализ фокусируется на высокоактивных бактериях и исключает покоящиеся и медленно растущие клетки. Здесь мы демонстрируем идентификацию бактериального планктона, использующего одно конкретное соединение DOC. Однако данный метод может быть применен и для изучения бактериального планктона, использующего другие единичные соединения DOC или группы DLC, такие как экссудаты водорослей.

Итак, возьмем образцы воды и приступим. Перед проведением анализа образцов воды на наличие бактериального планктона, разлагающего DOC, образцы воды должны быть надлежащим образом подготовлены. Образцы, представленные здесь, были собраны у побережья Джорджии; из них необходимо удалить крупные частицы и ER VRE.

Используя перистальтический насос, перенесите воду из сборного карбоя в установку для фильтрации с фильтром с размером пор 1 мкм. Затем перенесите аликвоты фильтрата объемом 36 мл в три стерильные полипропиленовые пробирки емкостью 50 мл, в каждой из которых находится 4 мл свежеприготовленного 10% раствора параформальдегида. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре для фиксации клеток после инкубации.

Налейте воду в фильтрационную колонку стеккой установки для вакуумной фильтрации с белыми мембранными фильтрами с размером пор 0.22 микрометра и включите вакуум для просасывания раствора. Промойте фильтр, пропустив через него 10 миллилитров PBS с помощью вакуума. Маркируйте фильтры как отрицательные контроли и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Для создания экспериментальной экосистемы или микрокосма начните с заполнения шести предварительно промытых стеклянных колб объемом один литр 800 миллилитрами предварительно отфильтрованного образца воды. Добавьте в каждый микрокосм BRDU до конечной концентрации 10 micromolar. Быстро перемешайте содержимое, вращая колбу вручную.

Каждый образец будет проанализирован в трех повторностях. Таким образом, в три микрокосма добавьте модельное соединение растворенного органического углерода (DOC). В данном случае реин добавляется в микрокосмы до конечной концентрации 100 nanomolar.

Затем в остальные три микрокосма добавьте стерильный PBS. Они будут служить контролем без DOC. Поместите все микрокосмы в встряхивающий инкубатор с частотой 100 RPM в темноте при температуре in situ, которая составляет 25 °C. Осуществляйте забор проб через 0, 8, 16 и 24 часа.

Соберите по 36 миллилитров из каждого микрокосма в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую четыре миллилитра свежего 10% параформальдегида; инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре для фиксации клеток. Затем профильтруйте зафиксированные клетки через белые мембранные фильтры с размером пор 0,22 микрометра. Пропустите 10 миллилитров PBS через вакуумный фильтр, чтобы вымыть остатки PFA.

Сразу приступайте к иммунодетекции INS situ или храните фильтры при температуре минус 20 °C для анализа включения BRDU в бактериальный планктон. Начните с выдерживания фильтров с образцами при комнатной температуре для размягчения клеточных стенок бактерий. Поместите фильтр в фильтрационную установку, затем пипеткой нанесите 1 mL раствора лизоцима на фильтр, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

После инкубации создайте вакуум для удаления раствора. Когда раствор пройдет через фильтр, промойте клетки, добавив 10 milliliters PBS, и снова создайте вакуум. Затем, чтобы дополнительно разрушить клеточную стенку, добавьте на фильтр один milliliter раствора протеиназы K так, чтобы он покрыл клетки.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Промойте раствором PBS для получения однослойных структур ДНК. Добавьте один миллилитр раствора экзонуклеазы так, чтобы он полностью покрывал клетки на фильтре.

Инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. После инкубации промойте фильтр, пропустив 10 мл PBS через вакуумный фильтр. Затем обрежьте края фильтра, чтобы удалить часть, не содержащую клеток.

Затем на сухой поверхности, очищенной спиртом, с помощью стерильного лезвия разрежьте фильтр на восемь равных частей. Для каждого образца потребуется восемь инкубационных камер с уплотнителем рамки; поместите одну восьмую часть фильтра в собранную инкубационную камеру с уплотнителем рамки стороной образца вверх. После сборки камер используйте набор Roche Intu для анализа пролиферации клеток для детектирования клеток, меченных A-B-R-D-U, in situ.

После завершения стандартных процедур извлеките секцию фильтра из инкубационной камеры и поместите ее на стерильную поверхность; с помощью стерильного лезвия разрежьте секцию фильтра на мелкие фрагменты. Перенесите фрагменты фильтра в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 1 мл PBS, плотно закройте пробирку и загерметизируйте ее парафильмом. Затем инкубируйте пробирку в шейкере при температуре 37 °C и скорости 200 RPM в течение 10 минут.

После инкубации плотно закройте пробирку и перемешайте её на вортексе на максимальной скорости. В течение пяти минут перенесите супернатант с помощью пипетки в стерильную полипропиленовую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем ресуспендируйте фильтр в PBS и повторите этапы вортексирования и инкубации еще дважды, каждый раз добавляя супернатант в ту же 15-миллилитровую пробирку для каждого образца.

Храните ресуспендированные клетки при температуре четыре градуса Цельсия. Анализ образца должен быть проведен в течение двух дней. Наконец, проведите сортировку клеток для выделения популяции с высоким уровнем включения BrdU.

В данной работе используются проточный цитометр BD FACS и соответствующее программное обеспечение. После сортировки клеток обогащенную BrdU популяцию можно проанализировать для определения ее таксономической принадлежности. Для амплификации генов 16S рибосомной РНК отсортированных бактерий с помощью ПЦР перенесите отсортированные клетки на белый поликарбонатный мембранный фильтр с размером пор 0.22 мкм и включите вакуумный насос; затем с помощью стерильного лезвия обрежьте края фильтра, не содержащие клеток.

Разрежьте фильтр на четыре равных фрагмента для каждого условия; поместите по одному фрагменту фильтра в каждую из трех пробирок для ПЦР так, чтобы клетки были обращены внутрь пробирки. Добавьте 45 µL воды степени чистоты для ПЦР. Дождитесь полного погружения фрагмента фильтра в воду.

Затем добавьте две бусины Roche illustra pure T ready to go PCR и кратковременно перемешайте на вортексе, чтобы помочь растворению бусин. Затем добавьте по два микролитра прямого и обратного праймеров к гену 16 s рибосомальной рНК.

Добавьте либо 1 µL BSA для поглощения ингибиторов амплификации, либо 1 µL воды. Проведите ПЦР-амплификацию в амплификаторе. Рекомендуется использовать программу touchdown-ПЦР, при которой температура отжига последовательно снижается с 62 до 52 °C на один градус Цельсия за цикл, с последующим проведением 15 циклов при 52 °C.

Подтвердите амплификацию ПЦР с помощью электрофореза в 1% Agros геле, окрашенном бромидом этидия; вырежьте ампликоны ПЦР из геля и очистите их с помощью набора KaiGen cayo quick gel extraction kit. После очистки ПЦР-продуктов из геля объедините ампликоны одного и того же образца. Очищенные ампликоны 16 s рибосомальной ДНК теперь готовы к проведению ряда молекулярных анализов.

Образцы были собраны на прибрежном участке в Джорджии и обработаны для изучения бактерий, разлагающих рацин, в соответствии с процедурами, описанными в данном видео. Рацин представляет собой полиаморное соединение, которое повсеместно встречается в морской среде. Как показано здесь, он может служить источником питательных веществ и энергии для морских бактерий.

Анализ данных образцов показал, что после 24-часовой инкубации в микрокосмах с добавлением рацина развилась группа бактерий с более высокой интенсивностью флуоресценции FXI, которая положительно коррелировала со степенью включения BRDU. Эти клетки были обозначены как клетки с высоким уровнем включения BRDU или HI; предполагалось, что они состоят преимущественно из бактерий, разлагающих рацин. Клетки типа hi не обнаружены.

Клетки были обнаружены в контрольных пробах без добавок, которые содержали только клетки с более низким уровнем включения BRDU, называемые lii-клетками; ожидалось, что в них будет преимущественно бактериальный планктон, не способный к утилизации. Добавленные клетки Racine HI были отсортированы по отдельным пробиркам, а затем собраны на мембранные фильтры. Частичные ампликоны гена 16S рибосомальной РНК были получены после ПЦР с фильтра и подтверждены методом гель-электрофореза.

После использования сортировочного фильтра можно провести ПЦР-амплификацию функциональных генов для анализа функционального разнообразия отсортированных клеток. Мы только что продемонстрировали вам способ физического разделения и идентификации функционально активных бактериальных клеток в водной среде с использованием подхода, сочетающего сортировку клеток с помощью флуоресцентно-активированного селл-сортинга и включение BrdU. Помните, что BrdU токсичен, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует использовать лабораторный халат и перчатки.

На этом всё. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.