ReAsH / Flash Маркировка и анализ изображений белков Tetracysteine ​​датчика в клетках

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы пометить клетки, экспрессирующие тетрацистеин и флуоресцентно меченный белок, красителями флэш или пепел, а также количественно проанализировать результаты. Это достигается путем первого пересечения плазмиды, несущей флуоресцентный белок, и целевого белка, содержащего метку тетрацистеина, в представляющую интерес клеточную линию. Затем экспрессированный белок помечают R или flash, а неспецифически связанный рацион удаляют путем промывки BAL для подготовки к микроскопической визуализации.

Затем с помощью конфокального микроскопа собираются флуоресцентные изображения клеток с пепловыми или вспышкой и флуоресцентными белковыми каналами. Наконец, изображения анализируют с использованием изображения J для количественной оценки связывания пепла или вспышки с белком-мишенью. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие степень пепла или мгновенного связывания с целевым белком в клетках через корреляцию флуоресценции пепла с флуоресценцией флуоресцентного белка.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как простое взятие целевого белка с GFP, заключается в том, что он может отслеживать второе свойство белка, такое как конформационные изменения в дополнение к его локализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области белковой субструктуры и функции, такие как события изации, конформационные изменения и события связывания LI, которые изменяют способность TAC к поглощению пепла или вспышки. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели оценить, как в клетках образуются малые субмикроскопические полигамные полигамные клетки Гантингтона.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этап анализа данных сложен для освоения, поскольку он технически сложен. Шаги с первого по третий будут выполнены Ясмин Рэнсон, научным сотрудником нашей лаборатории, которая продемонстрирует анализ данных. Четвертым шагом будет Севки Ган, аспирант нашей лаборатории: Использование стандартных методов клеточного культивирования для интересующей вас клеточной линии и предметного стекла для визуализации живых клеток, готового к трансфекции.

Подготовьте культуру клеток адгезии для трансфекции вашей плазмиды, содержащей интересующий ген TC-метки. В зависимости от выбранного метода трансфекции, важно иметь положительный и отрицательный контроль для оценки степени специфического связывания с метками TC, а также для оценки потока флюенса между каналами при сборе конфокальных микрофотографий. Таким образом, для двух цветов убедитесь, что образцы подготовлены для одного цвета, либо флуоресцентного белка сам по себе и, если возможно, белка T-ctech, связанного с плотью, либо против

флуоресцентного белка, но без него. Через один-два дня после трансфекции аккуратно промойте клетки 300 микролитрами довоенного раствора соли баланса Хэнка или HBSS, приготовьте свежий предварительно теплый HBSS с 10 микромолярами, одним, двумя, этаном диатиолом или EDT и одной микромолярной вспышкой или золой. А после удаления HBSS из клеток, аккуратно заменить на 300 микролитров зольную среду и инкубировать ровно 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур.

По нашему опыту, более длительное время инкубации значительно увеличивает фоновую флуоресценцию. Аккуратно оттолкните раствор для мечения из клеток и замените его 300 микролитрами предварительно подогретого HBSS с 250 микромолярами, двумя тремя димерами, пропанолом или БАЛ в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия. Удалите раствор для стирки с помощью щадящей аспирации и замените его 300 микролитрами предварительно подогретого HBSS.

После такой промывки клетки могут быть зафиксированы с параформной высотой, хотя мы обнаружили, что это увеличивает неспецифическую циничную флуоресценцию. Следовательно, мы обычно представляем себе клетки, живущие при комнатной температуре. Кроме того, фиксация клеток перед мечением предотвращает связывание биального красителя.

Чтобы начать визуализацию клеток на конфокальном микроскопе, настройте параметры для визуализации отдельных флуорофоров и убедитесь, что между каналами происходит незначительное кровотечение. Далее отрегулируйте настройки фотомножителя так, чтобы максимальная флуоресценция в образце не насыщала детектор. После определения наилучших настроек изображения не меняйте ни один из них между образцами.

Используйте частоту сканирования 200 Гц, соберите четыре средних значения линий и установите диаметр точечного отверстия на одну единицу площади. Диаметр точечного отверстия может быть увеличен, если сигнал/шум является проблемой. Однако это может привести к некоторой потере разрешения изображения.

По возможности соберите конфокальные изображения в формате 12 бит или выше. Максимально повысить качество количественного анализа данных. Соберите изображения для канала флуоресцентного белка, а также для канала кристалла BI arsenal для всех образцов.

Для анализа данных используйте программное обеспечение Image J со следующими плагинами. Если вы используете версию Image J старше версии 1.32 C, нажмите на следующие параметры. Чтобы разрешить одновременное открытие нескольких изображений, отредактируйте параметры ввода вывода косой черты, установите флажок для использования выбора файла для открытия косой черты.

Нажмите OK. Откройте интересующие изображения. Изображение J автоматически определит максимальную и минимальную интенсивность пикселей, отображаемую на экране для каждого изображения отдельно, потому что разные изображения будут иметь разную интенсивность пикселей.

Это означает, что отображаемые изображения не сопоставимы с просмотренными. Чтобы убедиться, что все открытые изображения имеют одинаковый масштаб, физически определите верхнюю и нижнюю интенсивность пикселей для просмотра. Чтобы установить эти значения, выберите изображение, отрегулируйте яркость, косую черту, контраст.

Нажмите на set, определите минимальное и максимальное отображаемые значения. Затем выберите «Распространить на все открытые изображения» и нажмите «ОК». Кроме того, можно поместить все изображения для определенного канала в один файл или стопку.

После этого Image J автоматически настроит все изображения в одном масштабе. Для этого выберите стеки изображений, изображения для стека, введите общее для каждого файла имя и выберите используемые заголовки в качестве меток. Нажмите OK.

Преобразуйте все открытые изображения в восьмибитные биты для анализа. При выборе восьмибитного типа изображения диапазон просмотра будет масштабирован с интервалом от нуля до 255. Важно не сохранять исходный 12-битный или более высокий формат, так как это приведет к потере информативности.

Сохраните копию в новой папке с именем eight bit, преобразованной с помощью опции «Сохранить как». Одним из методов изучения степени связывания биарсального штампа на всем изображении является построение графика корреляции интенсивности пикселей. На этом графике значение каждого пикселя в одном канале относительно соответствующего значения пикселя во втором канале.

Следовательно, положение пикселя с высоким уровнем флуоресценции GFP также будет высоким при флуоресценции пепла при наличии высокой связуемости. Чтобы проанализировать корреляцию между пикселями, убедитесь, что в изображении J открыты восьмибитные изображения REA и GFP. Затем откройте плагин коррелятора изображений, выбрав плагин коррелятора изображений. Назначьте файлы изображений первому и второму изображениям.

Затем нажмите OK. Полученный стек может не отображать никакой подробной информации. Это нормально.

Сохраните стек в новой папке с именем scatterplots и присвойте ему то же имя файла, что и образцу, к которому он относится. Например, график корреляции GFP пепла. Чтобы просмотреть данные, выберите один из двух вариантов.

Во-первых, преобразуйте данные так, чтобы они стали форматом журнала, выбрав process math log auto. Затем, чтобы визуально изменить масштаб данных, нажмите «Изображение», «Отрегулируйте яркость», «Косая черта», «Контраст» и выберите «Авто». Во-вторых, визуально измените масштаб данных, чтобы отображать только низкие значения, и отобразите данные с помощью специальной таблицы подстановки или таблицы LUT для создания пользовательской таблицы LUT.

Нажмите на цвет изображения, чтобы получить очень простую таблицу LUT. Нажмите на верхний левый пиксель и выберите черный цвет. Затем выделите следующий пиксель справа и выберите красный цвет.

Далее кликните по третьему пикселю, и удерживая кнопку мыши, перетащите выделение на правый нижний пиксель. Выберите красный цвет, нажмите OK, а затем выберите белый цвет и нажмите OK. Выберите диапазон яркости и контрастности от нуля до 255, как описано ранее, чтобы зафиксировать изображение на экране.

Конвертируйте его в формат RGB, чтобы копировать и вставлять изображения в другие программы. Сначала откройте восьмибитные или 16-битные изображения, как описано ранее. Назначьте цветовую схему LUT изображениям для GFP.

Назначьте зеленый LUT, кликнув по изображению. Посмотрите на столы зеленого цвета. Наконец, выберите изображение для копирования и скопируйте его в буфер обмена Выбрав «Редактировать копировать в систему», на этом рисунке показан типичный результат для слитого киназного носка, GFP и метки TC, которая была окрашена в течение 30 минут.

При наличии пепла в клетках HEC 2 9 3, по-видимому, ASH эффективно связывается с белком-мишенью, несущим TC-метку с высокой аффинностью. В отличие от этого, на этом рисунке показан соответствующий контрольный образец SARK, сросшийся с GFP, но лишенный метки TC, которая имеет важное значение для проверки как специфичности метки TC, так и уровня окрашивания фона. Этот результат показывает, что RH не имеет реакционной способности с белком-мишенью, в котором отсутствует TC-метка, что указывает на специфичность TC-метки для связывания SSH.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя позволять клеткам сливаться и успокаиваться, так как это повлияет на связывание V в клетках. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как просто анализировать свои данные количественно, и вы можете усовершенствовать эти методы для разработки своих собственных уникальных IUTS для визуализации данных.