Флуоресцентные наночастицы для измерения концентрации ионов в биологических системах

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании натриевых наносенсоров для применения in vitro и in vivo. Это достигается путем приготовления оптосмеси, содержащей компоненты сенсора для наносенсоров. На втором этапе ПАВ подвергают соникации в водном растворе для обеспечения равномерного распределения, что позволит сформировать наносенсоры при добавлении оптосмеси.

Затем смесь опто-компонентов добавляют к водному раствору ПАВ при воздействии ультразвука для формирования наносенсоров в растворе. В данном видео демонстрируется, что отклик сенсора может быть отрегулирован. Сенсоры можно вводить с помощью микроинъекций в кардиомиоциты, а также подкожно вводить мышам.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как флуоресцентные индикаторные красители, является возможность настройки датчиков на динамический диапазон, соответствующий физиологической среде, измерение более широкого спектра аналитов и проведение рациометрических измерений для количественного анализа. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут испытывать трудности, так как после изготовления датчиков их введение в биологическую среду может показаться сложной задачей. Растворы сухого иона натрия four x dry sodium TFPB и chromo four three необходимо подготовить до начала изготовления opto в соответствии с письменным протоколом.

В вытяжном шкафу поместите все материалы в стеклянный флакон объемом 1.5 milliliter. Закрутив крышку с тефлоновым покрытием, осторожно перемешайте содержимое на вортексе до полного растворения PVC. Раствор должен приобрести красный цвет.

Приступите к изготовлению наносенсоров, добавив 100 µL PEG-липида в концентрации 10 mg/mL в стеклянный флакон объемом 4 г. Затем добавьте 4 mL соответствующего водного раствора, например, 10 mM HEPES.

Погрузите наконечник соникатора на семь миллиметров в флакон с помощью лабораторного домкрата и примените низкую мощность ультразвука в течение 30 секунд. В пробирке объемом 0,6 мл смешайте 50 µL оптоматериала и 50 µL дихлорметана, используя пипетку для обеспечения равномерного перемешивания. Затем начните обработку ультразвуком в течение трех минут.

В начале соникации добавьте 100 µL оптосмеси, погрузив наконечник пипетки и введя весь объем одним быстрым равномерным впрыскиванием. Раствор станет синим, если pH поднимется выше 7 и если в системе отсутствует натрий для удаления остаточного ТГФ и дихлорметана из раствора. Переместите наконечник ультразвукового зонда на глубину 2 мм.

По истечении оставшихся трех минут раствор станет непрозрачным. После завершения соникации наберите раствор наносенсора в шприц объемом 5 мл. Установите фильтр и перенесите раствор наносенсора в стеклянный флакон с винтовой крышкой.

Начните с приготовления 10 растворов с постепенно увеличивающейся концентрацией натрия, по которым будет измеряться чувствительность наносенсора. Смешайте стоковые растворы натрия нулековой и единичной молярности в конических пробирках объемом 50 мл. Затем в 96-луночный планшет с оптическим дном добавьте по 100 µL раствора каждой концентрации натрия в три лунки одного столбца.

Затем добавьте по 100 µL свежеприготовленных наносенсоров в каждую лунку, поместите планшет в микропланшетный флуориметр и введите длины волн возбуждения, эмиссии и отсечки, оптимальные для используемого хромофора. Выбор измеряемых длин волн зависит от конкретной задачи. Эти длины волн позволяют измерять быструю внутриклеточную динамику или снижать уровень шума.

Для получения значений альфа разделите отношение интенсивности при 570 нанометрах на интенсивность при 670 нанометрах или 680 нанометрах. Постройте график зависимости значений альфа от логарифма концентрации натрия, приняв логарифм нулевой концентрации натрия равным минус одному.

Теперь постройте сигмоидальную кривую отклика и на основе этой кривой рассчитайте концентрацию натрия, при которой значение альфа составляет 0,5. Это значение представляет собой концентрацию натрия, при которой сенсор работает оптимально. Используя эти данные, скорректируйте соотношение sodium iono four x sodium TFPB и chromo iono four three в opto-смеси для создания наносенсоров с оптимальной концентрацией натрия.

Например, кривые отклика пяти различных наборов наносенсоров, представляющих разные оптоформуляции, которые различаются только количеством натрия из четырех 10. Для внутриклеточной визуализации замените среду культивирования клеток на прозрачную среду, такую как раствор Тайро, и перенесите клетки в камеру для визуализации. Теперь заполните подтянутую стеклянную пипетку раствором наносенсора, приготовленным в воде с концентрацией глюкозы 5 mg/mL.

Затем закрепите пипетку в микроманипуляторе и подключите её к системе инъекций с контролем давления. Опустите пипетку на клетку и введите её в цитоплазму. Иногда для прокола мембраны требуется слегка постучать по держателю манипулятора.

Введите несколько сотен пиколитров раствора наносенсора и быстро извлеките пипетку. Анестезируйте одну мышь линии CD-1 nude с помощью изофлурана в анестезирующей камере. После введения в состояние наркоза поместите мышь в продезинфицированную камеру для визуализации.

Затем наполните стерильный инсулиновый шприц калибра 31 10 µL наносенсоров с соответствующим значением KD в 10 mM PBS. Убедитесь, что все пузырьки воздуха удалены с помощью пинцета. Захватите небольшую складку кожи на спине мыши в выбранном месте инъекции.

Введите шприц под кожу так, чтобы срез иглы был направлен вверх, а сама игла располагалась параллельно поверхности кожи. Затем потяните поршень шприца на себя, чтобы убедиться, что игла не попала в кровеносный сосуд. Чтобы минимизировать обратное давление, осторожно перемещайте иглу вправо и влево, создавая в коже небольшое пространство.

Затем введите сенсоры и осторожно извлеките шприц. Слегка прижмите место инъекции и удалите раствор, который мог вытечь из места введения. Обычно вдоль спины делают шесть инъекций с равными интервалами.

При работе с разными мышами заменяйте иглу, чтобы свести к минимуму риск передачи заболевания и перекрестного загрязнения. После инъекций получите изображения в светлом поле и в режиме флуоресценции, используя наборы фильтров, которые максимально точно соответствуют спектрам возбуждения и эмиссии наносенсоров. Это также позволяет минимизировать автофлуоресценцию кожи.

Эти кардиомиоциты новорожденных культивировали на покровном стекле и инъецировали наносенсоры натрия. Данное флуоресцентное изображение получено при длине волны возбуждения 639 нанометров. Здесь представлено изображение тех же клеток в светлом поле, а здесь — совмещенное изображение обоих режимов.

Наблюдается некоторая кластеризация сенсоров, однако клетки сохраняют нормальную морфологию. Сенсоры диффундировали по всей цитозоли, ядерная локализация отсутствует. На этом совмещенном изображении в светлом поле и флуоресценции показаны девять различных подкожных инъекций наносенсоров натрия в подкожное пространство обнаженной мыши.

Изготовление наносенсоров Masten занимает считанные минуты при правильном выполнении; их можно применять в любом исследовании для измерения обратимых изменений концентрации аналита в режиме реального времени. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как вводить наносенсоры в внутриклеточное или подкожное пространство для проведения количественных измерений в биологической среде.