С памятью формы полимеров для активного культуры клеток

Общая цель этой процедуры заключается в культивировании клеток в субстрате с топографией, которая меняется с течением времени. Это достигается путем программирования полимера с памятью формы в постоянную форму, которую можно запомнить. Затем полимер с памятью формы программируется во временную форму, на которую позже наносится покрытие ячеек.

Заключительным этапом процедуры является запуск полимера с памятью формы для возвращения к его постоянной форме путем повышения температуры, в конечном итоге могут быть получены результаты, которые показывают изменение в поведении клетки с помощью флуоресцентной микроскопии. Здравствуйте, меня зовут Пэт Мазер. Я профессор биомедицинской и химической инженерии и директор Сиракузского института биоматериалов здесь, в Сиракузском университете.

Основное преимущество этой методики перед коммерческими или заказными аппаратами для растяжения клеток заключается в том, что в одной полимерной системе мы можем применять к клеткам широкий спектр сложных деформаций. Меня зовут Джей Хендерсон. Я доцент кафедры биомедицинской и химической инженерии и член Сиракузского института биоматериалов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механобиологии, например, как клетки реагируют на динамические изменения в своей физической среде. Меня зовут Кевин Дэвис, и я учусь в аспирантуре Сиракузского университета на факультете биомедицинской инженерии и химической инженерии. Хотя этот метод может дать представление о двухмерной механической биологии, он также может быть использован для других систем, таких как 3D-каркасы с изменением формы для тканевой инженерии.

Перед началом этой процедуры подготовьте индивидуальную камеру отверждения с помощью предметного стекла, тефлоновой прокладки толщиной в один миллиметр и алюминиевой пластины. Закрепите камеру с помощью небольших связующих зажимов, для начала введите NOA 63 в камеру через отверстие в тефлоновой прокладке с помощью иглы 18 калибра. Затем поместите камеру в горячую плиту, установленную при температуре 125 градусов Цельсия.

Дайте камере нагреться до равномерной температуры в течение пяти минут после нагрева камеры. Приобретите NOA 63 на 20 минут, расположив УФ-лампу на расстоянии 6,5 сантиметров от поверхности стекла. Извлеките NOA 63 из камеры, пока он еще теплый, с помощью лезвия бритвы.

Затем полимер с памятью формы отверждается под ультрафиолетовым светом в течение трех часов 40 минут непосредственно на горячей плите при температуре 125 градусов Цельсия. Чтобы охарактеризовать память формы NOA 63, подготовьте образец гантели путем горячего прессования отвержденной пленки с помощью специального пуансона. Наконец, поместите образец в динамический механический анализатор с приспособлением для растяжения.

Установите прибор в режим принудительного управления и запрограммируйте процедуру тестирования, как указано в письменном протоколе, прилагаемом к этому видео. Результатом процедуры является изотермически отвержденный формованный полимер с памятью или пленка SMP, помещающий CSMP в горячую пластину и устанавливающий температуру выше температуры стеклования, чтобы уменьшить модуль упругости и облегчить резку. Подготовить отдельные образцы из изотермически отвержденной s и p пленки.

Разрежьте пленку s и p бритвой до нужного размера образца. Временная форма может быть зафиксирована различными способами. Здесь. Настольный гидравлический пресс с пластинами, которые можно нагревать и охлаждать, используется для тиснения временной топографии.

Во-первых, установите температуру PLA на уровне выше tg. Для этой демонстрации был изготовлен тиснитель путем отверждения эпоксидной смолы на виниловой пластинке для создания временной формы параллельных канавок. Тиснитель может быть изготовлен из других материалов и с другой топографией, но должен быть жестче, чем у NOA 63.

При температуре тиснения поместите образцы s и p на тиснитель лицевой стороной вниз. Затем поместите образцы и тиснение в пресс. Приложите предварительную нагрузку массой около 100 кг Паскалей, чтобы обеспечить контакт между нагревательными PLA, и удерживайте образцы в течение примерно пяти минут, чтобы образцы достигли однородной температуры.

Как только будет достигнута равномерная температура, нанесите на образцы от одного до шести мегапаскаль и подержите в течение одной минуты. СМП сломается. Если прикладывается большее напряжение.

Применяйте меньшие напряжения для введения топографий с меньшими амплитудами. После приложения давления снизьте температуру до уровня ниже TG, используя возможность водяного охлаждения пресс-пластов. Когда температура ниже tg, уберите приложенное усилие перед началом эксперимента с активной клеточной культурой.

Ультрафиолетовое излучение шкафа биологической безопасности используется для стерилизации образцов. Разложите образцы лицевой стороной вниз в стерильной посуде без крышек и включите ультрафиолетовый свет на шесть часов. Затем переверните образцы в новые стерильные чашки в положении лицевой стороной вверх.

Включите ультрафиолетовый свет еще на шесть часов. Образцы должны быть уравновешены до относительно стабильного состояния перед нанесением покрытия на клетки. Поместите образцы в 96-луночную пластину и добавьте 150 микролитров полного роста.

Средний на лунку. Поместите планшет в инкубатор с температурой 30 градусов Цельсия и 5% CO2 до достижения желаемого частичного восстановления. Для этой демонстрации образцы инкубируют в течение 30 часов, чтобы получить достаточно большую амплитуду для выравнивания клеток.

Как только будет достигнуто частичное восстановление, образцы могут быть покрыты клетками. Поместите образцы в новую 96-луночную пластину. Затем добавьте 150 микролитров клеточного раствора в каждый из образцов здесь, C3 H 10 т с половиной.

Большинство эмбриональных фибробластов используются в концентрации 20 000 клеток на миллилитр. Чтобы получить изолированные клетки, позвольте клеткам прикрепиться и распространиться на временной топографии путем инкубации при 30 градусах Цельсия в течение 9,5 часов. Затем проанализируйте морфологию клеток перед переходом путем удаления образцов и выполнения окрашивания и флуоресцентной визуализации образцов.

Этот материал проявляет автофлуоресценцию через большую часть ультрафиолетового и видимого диапазона Флюорочетверы в дальнем красном конце спектра, такие как Alexa Fluor 6 47 рекомендуется для уменьшения фона для запуска образцов для восстановления, переместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и продолжайте культивирование в течение 19 часов. Это позволяет материалу восстановиться, а клеткам адаптировать свою морфологию к новой топографии. После инкубации нанесите соответствующие красители, такие как фаллин, для нитевидной визуализации актина.

В качестве последнего шага клетки могут быть визуализированы на новой топографии, показанной здесь, представляет собой объемную одностороннюю память формы одного лечения NOA 63. Повторяется три раза, где звездочка указывает на экспериментальное начало излечения. NOA 63 представляет собой прозрачное стекловидное твердое вещество, обладающее отличными свойствами памяти формы.

В этом случае материал был отвержден и показывает равномерную ТГ 51,1 градуса Цельсия, определенную с начала падения модуля накопления. Наблюдаемое здесь падение деформации происходит при измеренной tg. Большой процент приложенной деформации в 4,7% был зафиксирован после разгрузки при температуре 20 градусов Цельсия, что соответствует коэффициенту фиксации 89,3%. Затем фиксированная деформация была восстановлена в соотношении 84,4% в относительно небольшом диапазоне температур во время нагрева.

Производительность памяти формы не ухудшалась до трех циклов, о чем свидетельствуют все кривые, следующие почти по одному и тому же пути. Амплитуда временного рельефа уменьшается со временем при 30 градусах Цельсия на 30 часов. При 30 градусах по Цельсию.

Амплитуда была уменьшена примерно на 50%, как указано здесь в нулевой момент времени. Он снижается еще на 10% в течение следующих 9,5 часов. Когда восстановление запускается повышением температуры до 37 градусов Цельсия, амплитуда уменьшается до 0,5% от начальной амплитуды в течение 9,5 часов для используемого тиснения и напряжения тиснения 4,9 мегапаскалей.

Это соответствует функциональному изменению канавок размером 13 микрометров на почти плоскую поверхность. Этот полимер восстанавливается в диапазоне температур от 30 до 37 градусов в условиях культивирования клеток. Это происходит из-за поглощения воды из питательной среды, водный пластичный полимер, который снижает tg, позволяя восстанавливаться при температурах ниже сухой TG 51 градуса.

Примером поведения клетки, контролируемого с помощью активных субстратов клеточных культур, является изменение организации цитоскелета на временных бороздчатых субстратах. Перед началом восстановления актиновые микрофиламенты выравниваются по направлению бороздок. После восстановления за счет повышения температуры микроволокна реорганизуются и ориентируются хаотично.

И наоборот, контрольные образцы, имеющие статические, плоские или статические бороздки, не реорганизуются после повышения температуры. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что геометрия камеры отверждения, температура перехода полимера, метод фиксации деформации и состав самого полимера могут быть отрегулированы для достижения желаемого перехода в вашем собственном эксперименте. Другие методы, такие как ПЦР в реальном времени, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как изменение экспрессии генов в ответ на механическую стимуляцию субстратом после его развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области клеточной механобиологии к исследованию клеточной цитоскелетологии, перегруппировки и физики мягких веществ в двух измерениях. Спасибо за интерес к нашей работе и спасибо за просмотр.