С памятью формы полимеров для активного культуры клеток

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании клеток на субстрате с топографией, которая изменяется со временем. Это достигается путем первоначального программирования полимера с эффектом памяти формы в постоянную форму, которая может быть запомнена. Затем полимер с эффектом памяти формы программируется в временную форму, на которую впоследствии высевают клетки.

Заключительным этапом процедуры является запуск возврата полимера с памятью формы к его постоянной форме путем повышения температуры, что в конечном итоге позволяет получить результаты, демонстрирующие изменение поведения клеток с помощью флуоресцентной микроскопии. Здравствуйте, меня зовут Пэт Мэтир. Я профессор биомедицинской и химической инженерии и директор Института биоматериалов Сиракуз здесь, в Университете Сиракуз.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с коммерческими или специально изготовленными аппаратами для растяжения клеток заключается в том, что в рамках одной полимерной системы мы можем воздействовать на клетки широким спектром сложных деформаций. Меня зовут Джей Хендерсон. Я доцент кафедры биомедицинской и химической инженерии и член Сиракузского института биоматериалов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механобиологии, например, о том, как клетки реагируют на динамические изменения в своей физической среде. Меня зовут Кевин Дэвис, я аспирант кафедры биомедицинской и химической инженерии Сиракузского университета. Хотя данный метод позволяет получить представление о двухмерной механической биологии, он также может быть использован для других систем, таких как трехмерные каркасы с изменяемой формой для тканевой инженерии.

Перед началом данной процедуры подготовьте специальную камеру для отверждения, используя предметное стекло, тефлоновый спейсер толщиной 1 мм и алюминиевую пластину. Закрепите камеру с помощью небольших биндер-клипов, затем с помощью иглы 18 G введите NOA 63 в камеру через отверстие в тефлоновом спейсере. После этого поместите камеру на нагревательную плитку, установленную на 125 °C.

После нагрева камеры дайте ей прогреться до равномерной температуры в течение пяти минут. Полимеризуйте NOA 63 в течение 20 минут, расположив УФ-лампу на расстоянии 6,5 сантиметров от поверхности стекла. Извлеките NOA 63 из камеры, пока он еще теплый, используя лезвие бритвы.

Затем проведите дополнительное отверждение полимера с эффектом памяти формы под воздействием УФ-излучения в течение 3 часов и 40 минут непосредственно на нагревательном планшете при 125 °C. Для характеристики эффекта памяти формы NOA 63 подготовьте образец в форме гантели, подвергнув отвержденную пленку горячему прессованию с использованием специализированного просекателя. В завершение закрепите образец в динамическом механическом анализаторе с использованием растяжной зажимной оснастки.

Переведите прибор в режим контроля усилия и запрограммируйте процедуру испытания согласно письменному протоколу, прилагаемому к данному видео. Результатом процедуры является изотермически отвержденная пленка из полимера с эффектом памяти формы (SMP). Поместите пленку из SMP на нагревательную пластину и установите температуру выше температуры стеклования, чтобы снизить модуль упругости и облегчить резку. Подготовьте отдельные образцы из изотермически отвержденной пленки из SMP.

Обрежьте пленку s и p лезвием до нужного размера образца. Временную форму можно зафиксировать несколькими разными способами. В данном случае для создания временного рельефа методом тиснения используется настольный гидравлический пресс с плитами, которые могут нагреваться и охлаждаться.

Сначала установите температуру ПЛА выше значения tg. Для данной демонстрации штамп был изготовлен путем отверждения эпоксидной смолы на виниловой пластинке для создания временной формы с параллельными канавками. Штамп может быть изготовлен из других материалов и иметь иную топографию, но он должен быть жестче, чем NOA 63.

При температуре тиснения поместите образцы s и p лицевой стороной вниз на тиснителе. Затем поместите образцы и тиснитель в пресс. Приложите предварительную нагрузку примерно 100 kilo pascals для обеспечения контакта между нагреваемыми пластинами (PLA) и образцами; выдержите около пяти минут, чтобы образцы достигли равномерной температуры.

После достижения равномерной температуры приложите к образцам давление от одного до шести мегапаскалей и выдержите в течение одной минуты. SMP подвергнется разрушению. Если приложить большее напряжение.

Применяйте меньшие нагрузки для создания топографии с меньшей амплитудой. После приложения давления снизьте температуру до значений ниже TG, используя систему водяного охлаждения плит пресса. Когда температура упадет ниже tg, снимите приложенную силу перед началом эксперимента по активному культивированию клеток.

УФ-излучение в боксе биологической безопасности используется для стерилизации образцов. Разместите образцы лицевой стороной вниз в стерильных чашках без крышек и включите УФ-лампу на шесть часов. Затем перенесите образцы в новые стерильные чашки, расположив их лицевой стороной вверх.

Оставьте включенным УФ-излучение еще на шесть часов. Образцы должны прийти в относительно стабильное состояние перед посевом клеток. Поместите образцы в 96-луночный планшет и добавьте 150 µL полной среды для роста.

Среды на лунку. Поместите планшет в инкубатор при температуре 30 °C и 5% CO2 до достижения необходимой степени частичного восстановления. В данном демонстрационном примере образцы инкубируют в течение 30 часов, чтобы получить амплитуду, достаточную для выравнивания клеток.

После достижения частичного восстановления образцы можно использовать для посева клеток. Поместите образцы в новый 96-луночный планшет. Затем добавьте по 150 µL клеточной суспензии в каждый из образцов, С3 H 10 t и наполовину.

Большинство эмбриональных фибробластов используют в концентрации 20 000 клеток на миллилитр. Для получения изолированных клеток дайте им прикрепиться и распределиться по временной топографии, инкубируя их при 30 °C в течение 9,5 часов. Затем, перед переходом, оцените морфологию клеток, отобрав образцы и проведя их окрашивание и флуоресцентную визуализацию.

Этот материал проявляет автофлуоресценцию в большинстве диапазонов УФ и видимого спектра; для снижения фонового сигнала рекомендуется использовать флуорофоры дальнего красного конца спектра, такие как Alexa Fluor 647. Чтобы образцы восстановились, переместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и продолжайте культивирование в течение 19 часов. Это позволит материалу восстановиться, а клеткам — адаптировать свою морфологию к новой топографии. После инкубации нанесите соответствующие красители, например, фаллоидин для визуализации филаментозного актина.

На заключительном этапе можно провести визуализацию клеток на новой топографии; здесь показана объемная односторонняя память формы одного отвержденного образца NOA 63. Процедура была повторена трижды, где звездочкой отмечено начало экспериментального отверждения. NOA 63 представляет собой прозрачное стеклообразное твердое тело с отличными свойствами памяти формы.

В данном случае материал был отвержден и демонстрирует однородную температуру стеклования TG 51.1 °C, определенную по началу падения модуля накопления. Падение деформации, наблюдаемое здесь, происходит при измеренном значении tg. Значительная часть приложенной деформации 4.7% зафиксировалась после снятия нагрузки при 20 °C, что соответствует коэффициенту фиксации 89.3%. Затем фиксированная деформация была восстановлена с коэффициентом 84.4% в относительно узком температурном диапазоне при нагреве.

Характеристики эффекта памяти формы не ухудшались на протяжении трех циклов, о чем свидетельствует тот факт, что все кривые проходят почти по одной и той же траектории. Амплитуда временного рельефа уменьшается со временем при 30 °C в течение 30 часов. При 30 °C.

Амплитуда была снижена примерно на 50%, что указано здесь для нулевого момента времени. В течение следующих 9,5 часов она снижается еще на 10%. При запуске восстановления путем повышения температуры до 37 °C амплитуда снижается до 0,5% от начальной амплитуды в течение 9,5 часов для используемого эмбоссера и напряжения тиснения 4,9 МПа.

Это соответствует функциональному переходу от канавок размером 13 мкм к почти плоской поверхности. Данный полимер восстанавливается в температурном диапазоне от 30 до 37 °C в условиях культивирования клеток. Это происходит за счет поглощения воды из культурной среды; вода пластифицирует полимер, что снижает tg, позволяя восстановлению происходить при температурах ниже температуры стеклования сухого полимера, которая составляет 51 °C.

Примером поведения клеток, контролируемого с помощью активных подложек для культивирования, является изменение организации цитоскелета на временных рифленых подложках. До инициации восстановления актиновые микрофиламенты выстраиваются вдоль направления желобков. После восстановления, вызванного повышением температуры, микрофиламенты реорганизуются и ориентируются случайным образом.

Напротив, контрольные образцы со статическими плоскими поверхностями или статическими бороздами не подвергаются реорганизации после повышения температуры. При выполнении данной процедуры важно помнить, что геометрия камеры отверждения, температура стеклования полимера, метод фиксации деформации и состав самого полимера могут быть адаптированы для достижения переходов, необходимых в вашем конкретном эксперименте при следовании данной методике. Другие методы, такие как ПЦР в реальном времени, могут быть использованы для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о том, как изменяется экспрессия генов в ответ на механическую стимуляцию со стороны подложки после её создания.

Этот метод открыл исследователям в области механобиологии клетки возможность изучать перестройку цитоскелета и физику мягкого вещества в двух измерениях. Благодарим вас за интерес к нашей работе и за просмотр.