Лентивирус-опосредованной генетических манипуляций и визуализация Обонятельные сенсорные нейроны В естественных условиях

Одной из проблем изучения развития в нейронауке является захват дендритной и аксональной морфологии на уровне одной клетки in vivo. В обонятельной системе обонятельные сенсорные нейроны простирают свои аксоны от обонятельного эпителия в носу до обонятельной луковицы в мозге. Когда несколько обонятельных сенсорных нейронов проецируются к обонятельной луковице, они объединяются в пучки.

Это усложняет изучение индивидуальных траекторий аксонов и их терминальной морфологии. Мы разработали метод визуализации одиночных обонятельных сенсорных нейронов in vivo путем микроинъекции конструкции GFP. Несущий лентивирус.

Успешная трансдукция лентивирусом освещает всю длину обонятельного сенсорного аксона, включая терминальный арбор. В дополнение к визуализации отдельных обонятельных сенсорных нейронов, этот метод позволяет нам манипулировать экспрессией генов конкретного гена, представляющего интерес, для изучения его функции в контексте in vivo. Эта процедура лентивируса имеет второй уровень биобезопасности и должна выполняться в ламинарном вытяжном шкафу.

Для поддержания стерильной среды распылите все, что вставлено в вытяжку, с 70% этанолом в вытяжке, подготовьте и предварительно прогрейте водяную кровать с температурой 37 градусов не менее 20 минут. Перед инъекцией. Закройте пластиковый пакет для хранения, наполовину заполненный водой, и установите его на пустой инкубатор с нагревательным блоком.

Это позволит мышам восстановиться после инъекции. Наполните контейнер для биологически опасных отходов 10% отбеливателем, чтобы обеззаразить все материалы, подверженные воздействию вируса. Из этой процедуры приготовьте небольшую открытую посуду из 70% этанола и вторую посуду со стерильной дистиллированной водой.

В колпаке с ламинарным потоком мы будем использовать шприц Hamilton емкостью пять микролитров с иглой 33 калибра. Именно эта модель позволяет регулировать сопротивление плунжера путем поворота диска натяжения, расположенного в верхней части камеры плунжера. Эта функция обеспечивает контроль объема микроинъекций для стерилизации камеры иглы и шприца.

Многократно аспирируйте и выбрасывайте этанол из чашки несколько раз. Промойте картридж шприца, отасунув и выпустив стерильную воду несколько раз. Надежно отложите шприц в сторону в проточном колпаке.

Разложите спиртовые салфетки рядом со станцией инъекций. Подготовьте этап инъекции, обеспечивающий приподнятую поверхность, облегчающую позиционирование мыши. Можно использовать перевернутую 10-сантиметровую тарелку для культуры, покрытую салфетками Кима.

Детеныши мышей могут находиться под наркозом при гипотермии до возраста отлучения от груди. Вырежьте из пальца резиновую перчатку и поместите мышонка в вырез для пальца. Затем выложите на лед на пять минут.

Перчатка предотвратит ожоги кожи, которые могут возникнуть при прямом контакте кожи со льдом, для тщательной анестезии путем ущипывания щенка за заднюю часть и четыре ноги, чтобы убедиться, что животное не реагирует. Теперь мы готовы к микроинъекциям лентивируса. Мы проведем демонстрацию на новорожденном щенке.

Если используется мышь более старшего возраста, следует заменить иглу 33 калибра на более толстую иглу калибра, чтобы проникнуть в поверхность черепа. Простерилизуйте поверхность носа мыши, протерев ее спиртовой салфеткой. Достаньте запасы лентивируса из морозильной камеры и разморозьте на льду.

Мы сами произвели лентивирус в лаборатории с использованием отработанных методов. Разрабатывая этот метод, мы обнаружили, что для хорошей скорости трансдукции требуется минимальный титр вируса от 10 до 9 инфекционных единиц на мил. Отаскайте два микролитра стокового раствора лентивируса в стерилизованный шприц Гамильтона.

Поместите мышонка на верхнюю часть ступени инъекции. Возьмитесь за кожу на макушке у ушей и аккуратно оттяните назад. Мы оснастили наш проточный колпак препарирующим эндоскопом.

Чтобы точно направить микроинъекции, найдите контур обонятельной луковицы на тыльной поверхности черепа в передней части мозга. Наши мишени для микроинъекций плотно окружают обонятельную луковицу, но не должны включать саму луковицу. Мы делаем четыре инъекции в обонятельный эпителий каждого щенка.

Эти позиции, представленные синими точками, требуют, чтобы игла была введена под углом, направленным медиально. Дополнительные две инъекции, представленные зелеными точками, расположены в шахматном порядке, более медиально и спереди от обонятельной луковицы. Эти инъекции можно делать под углом.

Рекомендации по углам наклона игл сделаны с учетом вентрального расположения обонятельного эпителия, который в основном расположен под обонятельной луковицей. Таким образом, перпендикулярный доступ ограничен. Введите иглу через верхнюю часть носовой полости примерно на три миллиметра ниже поверхности кожи.

Для достижения обонятельного эпителия. Тренированная рука должна ощущать падение сопротивления при достижении просветного пространства носовой полости. Этой области следует избегать.

Микроинъекции 0,5 микролитра исходного раствора вируса на каждую позицию. Опять же, выбирая по две площадки с каждой стороны, как левую, так и правую, четыре инъекции суммарно по 0,5 микролитра. Каждая мышь означает два микролитра вируса, необходимых на одну мышь за один сеанс инъекции.

Опять же, будьте осторожны, чтобы не вводить в обонятельную луковицу промокать насухо остатки раствора вируса или крови, которые могут выйти из места инъекции или отверстий ноздрей. С помощью этаноловой салфетки утилизируйте салфетки в разбавленной жидкости отбеленной емкости, немедленно поместите введенную мышь в инкубатор с водяной кроватью для восстановления. Обеззараживание игольчатого шприца путем повторения процедуры стерилизации, выполненной во время подготовки Инъекционные мыши могут быть возвращены в клетку через 30 минут после выздоровления в инкубаторе с водяной кроватью.

Всю эту микроинъекцию можно повторить снова через четыре часа. Если вы хотите увеличить количество инфицированных обонятельных сенсорных нейронов, инфицированные обонятельные сенсорные нейроны могут быть визуализированы по всей длине клетки всего за три дня. Животных приносили в жертву и перфузировали для наблюдения в нужный момент времени.

Используя стандартные методы Чтобы визуализировать трансдуцированные траектории обонятельных сенсорных нейронов и концы аксонов, мы препарируем и разрезаем корональную обонятельную луковицу толщиной 60 микрон. Таким образом, секция будет содержать все клеточные слои обонятельной луковицы, включая пучки аксонов обонятельных сенсорных нейронов и окончания аксонов, которые образуют клубочковые структуры, связанные на поверхности луковицы при подготовке к плавающей иммуногистохимии. Изготавливаются последовательные срезы обонятельной луковицы, которые коллективно помещаются в 10-сантиметровую чашку для культуры с пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера.

Переложите плавающие секции в конический флакон объемом 50 миллилитров. После того, как срезы осядут на дно флакона, вакуумируйте фосфатный буферный раствор. Будьте осторожны и не пылесосите.

Ваши секции пополняются 10 миллилитрами свежего буфера, чтобы смыть остатки фиксирующего или закладывающего материала. Немедленно пипетируйте эту ресуспензию в конический флакон объемом 15 миллилитров, убедившись, что все плавающие секции, вакуумируйте раствор для промывки и перфорируйте срезы раствором 0,3% Triton X 100 в фосфатном буфере и солевым раствором поместите на платформу-качалку на 10 минут. При комнатной температуре вы можете пройти стандартный протокол иммуноокрашивания в том же коническом флаконе, повторяя этапы вакуума и качалки по мере необходимости для сосуда этого размера, сохраняя объем 10 миллилитров для этапов окрашивания и полоскания.

Вот список антител, которые мы используем для окрашивания положительно трансдуцированных обонятельных сенсорных нейронов и общей популяции обонятельных сенсорных нейронов. Для полного проникновения антител в секции луковицы размером 60 микрон рекомендуется проводить инкубацию в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Глубина стирки также должна быть не короче 20 минут каждая.

Аккуратно распределите каждый участок на предметном стекле с помощью кисти, закрепите каждую горку флорой Mount G, дополненной раствором морилки хроматина. Приложите усилия, чтобы удалить все пузыри из монтажной среды. Монтируйте разделы рядами, чтобы упростить последующий этап отсеивания.

Отсканируйте эти слои на срезах иммуноокрашиваемой луковицы на наличие GFP-положительных аксонных волокон и концов. С помощью флуоресцентного микроскопа можно визуализировать инфицированные нервные окончания с помощью конфокальной микроскопии. Полезно откалибровать фокальную плоскость в области интереса с помощью DPI и обонятельных маркерных белковых каналов.

Эти результаты показывают, что одно волокно аксона обонятельного сенсора нейрона и окончание аксона в клубочке, который представляет собой CO с белком-маркером обоняния красного цвета и двумя в сером цвете, инфицированными телами нейронов обонятельного сенсора и их дендритным бугорком, также могут быть визуализированы в обонятельном эпителии, если эта ткань была включена в этапы диссекции и иммуноокрашивания. Здравствуйте, моя конфокальная проекция дает нам очень подробную морфологию одного обонятельного сенсорного нейрона, пути аксонального расширения и терминального арбора. Можно увидеть зацепление волокна аксона обратно к его клубочковой мишени, а также детали его разветвления внутри клубочковой нейротаблетки.

Метод лентивирусной микроинъекции позволяет визуализировать аксоны одиночных клеток, морфологию обонятельных сенсорных нейронов, а также позволяет проводить исследования, манипулирующие экспрессией генов, трансдукцию лентивируса приводит к стабильной геномной интеграции конструкций. Лентивирус не транссинаптически инфицирует соседние клетки. Визуализация может быть достигнута всего за три дня, подтверждено, что она длится не менее трех месяцев и, вероятно, сохраняется в течение более длительных периодов времени.

Обонятельные сенсорные нейроны не так легко инфицируются при назальной инфузии раствора лентивируса. Поэтому в этой процедуре требуется микроинъекция через поверхность. Итак, это наша процедура микроинъекции лентивируса.

Я надеюсь, что вы нашли всю эту информацию полезной для достижения морфологии одиночных клеток вашей собственной охоты Хэппи.