Подготовка взрослых Drosophila Глаза для тонких Секционирование и микроскопический анализ

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы подготовить глаза взрослой дрозофилы к тонкому срезу, что позволит детально оценить мутантные фенотипы глаз, такие как дефекты полярности планарных клеток. Это достигается путем предварительного срезания голов у мух, находящихся под наркозом. Затем ткань глаза фиксируется и погружается в эпоксидную смолу.

Как только смола застынет, встроенные глазки обрезаются. Для секционирования заключительным этапом является тонкое рассечение глаз с помощью микротома, оснащенного алмазным ножом. В конечном счете, анализ глазного среза позволит охарактеризовать фенотипы глаз новых мутантов или количественно оценить генетические взаимодействия между генами сигнального пути, такого как PCP-путь.

И то, и другое поможет охарактеризовать физиологическую роль вновь идентифицированных генов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области дрозофил, например, как новые мутации влияют на развитие глаз или как гены взаимодействуют в анализах генетического взаимодействия. Несколько этапов процедуры встраивания глаз, такие как выравнивание глаз в секционных формах, намного проще для понимания, которые на самом деле, а не в текстовой форме, надевают пару перчаток для подготовки к фиксации голов мух и глутаральдегида и осмия, оба из которых являются токсичными химическими веществами.

Затем обезболите мух с помощью CO2 и выложите их на подушку для мух, защищенную бумагой Ватмана, под микроскопом для препарирования, обычно отсортируйте шесть мух плюс еще одну, чтобы убедиться, что шесть головок мухи на каждый генотип, удерживайте и осторожно прижмите грудную клетку мухи пинцетом, а затем удалите голову мухи с помощью скальпеля. Стабилизируйте головку мухи, коснувшись пинцетом горлышка и аккуратно отрежьте небольшую часть одного глаза, чтобы усилить проникновение фиксатора. Коснитесь головы пинцетом или скальпелем поверхности отрезанного глаза, чтобы перевести голову в фиксатор глутаральдегида фосфата на льду. Обязательно надевайте перчатки на протяжении всего процесса фиксации.

Сначала пометьте все плесени, чтобы отслеживать различные генотипы. Затем заполните каждую форму 100% смолой, стараясь не переполнить их. Верх должен быть ровным по всей поверхности.

С помощью переводной пипетки удалите 50% смолу с головок. Замените на 100% смолу и выдерживайте в течение трех-четырех часов при комнатной температуре. По мере того, как головки уравновешиваются в смоле в течение инкубации, они опускаются на дно трубки.

Ударьте зубочисткой по твердой поверхности, чтобы получился небольшой крючок. С помощью этого инструмента перенесите по одной головке мухи в каждую форму. Поместите алюминиевую фольгу на рабочую поверхность препарирующего микроскопа, чтобы защитить ее от пролитой смолы.

С помощью препарирующего прицела используйте иглу для препарирования, чтобы слегка и осторожно покрутить голову. Переместите его на дно формы, ближе к заостренному концу. Тщательно выровняйте поверхность неповрежденного глазка с передней стенкой формы горлышком вниз.

Обязательно держите тангенциальную поверхность глаза, примерно на расстоянии половины диаметра головы от стенки формы. Если глаза двигаются при извлечении иссекающей иглы, измените желаемое положение глаз, быстро отведите иглу немного в сторону от головы, а затем медленно полностью удалите иглу. После того, как все головы будут выровнены, еще раз проверьте все глаза, чтобы убедиться, что они не двигаются.

Когда вы извлекли иглу из смолы, если таковая имеется или косая, выровняйте головку, перенесите формочки в духовку и запекайте ее при температуре 70 градусов в течение ночи. После выпекания в течение ночи выньте затвердевшие блоки из форм, согнув формы. Отслеживайте, какой блок соответствует какому генотипу, храня их в помеченных контейнерах.

Чтобы обрезать блоки, установите блок на патрон для микротома таким образом, чтобы глаз был направлен вверх под зоной препарирования. С помощью лезвия бритвы с тефлоновым покрытием аккуратно срезайте только верхний слой блока. Это оставляет четкую поверхность, через которую можно увидеть глаз и установить плоскость разреза.

Далее отрежьте излишки пластика с обеих сторон головы и спереди, пока не будет срезана большая часть пластика вокруг головы. Лучше всего медленно приближаться к голове, срезая несколько тонких слоев пластика с помощью чистого лезвия бритвы. Аккуратно удалите тонкие слои с верхней части глаза в точно нужной плоскости разреза.

Обязательно используйте свежие участки лезвия бритвы для каждого пореза и продолжайте до тех пор, пока не будет достигнута внешняя поверхность глаза. Получившийся обрезанный блок будет представлять собой трехгранную пирамиду со слегка наклоненной срезанной вершиной, которая соответствует плоскости секционирования. Установите блок в микротом и начните секционирование.

До тех пор, пока не будет сгенерировано от 20 до 30 секций, получившиеся секции будут плавать на поверхности воды в водоеме. Поместите горку на нагревательную плиту, установленную на 100 градусов Цельсия. Затем поднимите первую партию секций с приплюснутым концом деревянной ватной палочки из-под поверхности воды с помощью вращательного движения, а затем перенесите их в каплю воды.

На горке подождите, пока вода испарится и секции прилипнут к горке, а затем повторите с еще 20-30 секциями. Как правило, секции из трех глаз, расположенные в шести каплях воды, хорошо помещаются на одном предметном стекле. После того, как все срезы собраны на предметном стекле, их можно окрашивать и монтировать для микроскопии в тангенциальном срезе через глаз дикой мухи.

ТИА демонстрируют нормальную полярность и хорошо ориентированы относительно дорсальной вентральной линии симметрии, которая проиллюстрирована желтой линией на схеме ниже. В отличие от хорошо ориентированного тии глаза дикого типа, у мутантного глаза с косоглазием полярность тиала теряется, и даже несмотря на присутствие полного комплемента фоторецепторов, вращение и альность рандомизируются. Также обратите внимание на отсутствие пигмента решетки пигментных клеток и отдельных фоторецепторных клеток.

Поскольку мутант косоглазия находился на генетическом фоне белого минуса, дрозофила рокиназа или капля является гомозиготной летальной мутацией, которая, таким образом, требует клонального анализа. Здесь гомозиготные мутантные клоны Dr.Homozygous характеризуются отсутствием пигмента и дефектами вращения, а также структурными дефектами, включая отсутствие или избыток фоторецепторных клеток на уровне отдельных клеток. Примеры мутантных и диких фоторецепторов обозначены открытыми или заполненными синими стрелками соответственно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как встраивать и разделять глаза мухи. В течение примерно трех дней. Вы должны регулярно иметь возможность детально анализировать фенотипы глаз, что позволит вам рассмотреть функцию новых генов во время развития глаза.