Белки мембранные наложения Пробирной: протокол для тестирования Взаимодействие растворимых и нерастворимых белков В пробирке

Тестирование белка. Взаимодействие белков необходимо для препарирования функциональности белка. В этом видео представлен анализ связывания белка in vitro для проверки взаимодействия мембраны и иммобилизованного белка с растворимым белком.

Во-первых, гибридные белки клонируются, экспрессируются и экстрагируются. Меченый нерастворимый белок иммобилизуется на мембране из нитроцеллюлозы и обрабатывается до повторного сворачивания до его нативного подтверждения. Затем мембрану зондируют с помощью меченых растворимых белков и проводят иммуноблоттинг для обнаружения белков.

Если помеченные белки взаимодействуют, они захватываются белком, обездвиженным на мембране, и будет наблюдаться сигнал от иммуноблоттинга. Таким образом, этот анализ обеспечивает надежный метод проверки взаимодействия между нерастворимым белком и белком в растворе. Основное преимущество этой методики перед существующими сосудами, такими как GST pull down, заключается в том, что можно достоверно оценить связывание между нерастворимым белком и растворимым белком in vitro.

Первым шагом этой процедуры является создание генетически помеченных белков для обнаружения. Начните с клонирования белка, который будет иммобилизован на мембране. Здесь мы называем pro Im для иммобилизованного белка в вектор экспрессии, кодирующий большую метку, такую как GST, пустой вектор экспрессии, который кодирует только для метки, будет использоваться в качестве отрицательного контроля иммобилизованного белка, и называется pro IM nc.

Затем клонируйте белок, который будет использоваться в качестве растворимого зонда, в вектор экспрессии, кодирующий другую метку, такую как стрептококк два. Это будет называться прозолом для растворимого белка в качестве отрицательного контроля, клона, отрицательного контроля растворимого белка в том же векторе экспрессии. Это будет называться Prosol NC для контроля отрицательного уровня растворимого белка.

Затем используйте систему экспрессии белков, такую как coli или balo virus, для экспрессии меченых белков. Извлеките экспрессированные белки из организма по выбору. Для pro IM и pro I mnc Resus.

Приостановите ячейки в буфере загрузки страницы SDS, содержащем коктейль ингибиторов протеазы. Затем прокипятите клетки в течение пяти минут, затем центрифугируйте их, чтобы удалить осадок для извлечения Prosol и Prosol NC. Используйте стандартные процедуры. Про IMS может быть экстрагирован в условиях денатурации, потому что белки будут сворачиваться после иммобилизации в нитроцеллюлозной мембране.

Тем не менее, просол должен быть экстрагирован для получения нативного подтверждения, потому что они будут добавлены в связывающий буфер после того, как меченые белки будут экстрагированы. Определите концентрацию рекомбинантных белков с помощью стандартного метода, такого как набор для анализа белка BioRad. Если для анализа будет использоваться сырой экстракт, а не очищенный белок.

Оцените концентрацию интересующего белка путем сканирующей денситометрии соответствующей полосы на окрашенном полиакриламидном геле СДС, окрашенном кумаси. Использование известных концентраций БСА в качестве эталона. Затем постройте стандартную кривую на основе интенсивностей сигнала, измеренных с помощью сканирующей денситометрии BSA, и рассчитайте количество белка, содержащегося в сыром экстракте.

Следующим этапом процедуры является иммобилизация pro Iam и pro IAM NC на мембране. Начните с загрузки по одному микрограмму, каждый из экстрактов pro Iam и pro IAM NC в двух экземплярах, на полиакриламидный гель SDS. После электрофореза снимите гель со стеклянных пластин и поместите его в 100 миллилитров буфера для переноса, затем инкубируйте с легким перемешиванием в течение 20 минут при комнатной температуре.

После инкубации проведите вестерн-блоттинг для переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану после переноса, чтобы позволить связанным с мембраной белкам восстановиться. Поместите мембрану в 15 миллилитров буфера А и инкубируйте его при легком перемешивании. Для удаления остатков SDS инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании.

После инкубации осторожно извлекают мембрану из буфера. Затем поместите мембрану в 25 миллилитров денатурационного буфера. Выдерживать в течение двух часов при комнатной температуре при слабом перемешивании.

Во время инкубации нитроцеллюлозная оболочка станет непрозрачной. Далее с помощью щипцов перенесите на мембрану 25 миллилитров TBS и выдерживайте при слабом взбалтывании в течение пяти минут. На этом этапе мембрана возвращается к своему первоначальному белому цвету.

Далее перенесите на мембрану 25 миллилитров связующего буфера. Инкубировать при температуре четыре градуса Цельсия при слабом перемешивании в течение ночи. Затем растворимый белок будет использован для зондирования мембраны на наличие иммобилизованного белка.

Сначала приготовьте гибридизационные буферы, разведите от одного до 10 мкг просола и прозола NC в отдельных пробирках, содержащих 10 миллилитров свежего связывающего буфера. Затем переложите буфер в мешок для гибридизации. Далее разрежьте мембрану на две полоски, обе содержат pro IM и pro IAM nc.

Эти мембраны будут помещены в буфер для гибридизации. Переложите каждую мембрану в раствор для гибридизации prosol или prosol NC и инкубируйте в течение 1,5 часов при комнатной температуре при слабом перемешивании. Удалите мембраны из гибридизационных растворов и промойте три раза в течение 15 минут в TBS.

Чтобы визуализировать белковые взаимодействия, заблокируйте мембрану 2,5%-ным обезжиренным молоком в TBST на один час. После инкубации поместите заблокированные мембраны в раствор первичного антитела. Здесь используется антис стрептококк два поликлональных антитела кролика.

Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре с легким перемешиванием после инкубации. Промыть мембраны в 20 миллилитрах TBST в течение 15 минут и дважды в течение пяти минут при комнатной температуре при слабом перемешивании. Затем поместите мембраны в раствор конъюгированного вторичного антитела HRP Здесь используется антитело IgG против кролика, конъюгированное с HRP.

Выдерживать в течение часа при комнатной температуре при слабом перемешивании. Промойте мембраны в 20 миллилитрах TBST в течение 15 минут и дважды в течение пяти минут при комнатной температуре с легким перемешиванием, как и раньше, после окончательной промывки в TBS, визуализируйте взаимодействие белков с помощью хемилюминесцентного субстрата HRP Here Millipore. Им Молан Западный Хемилюминесцентный.

Субстрат HRP используется после иммуноблоттинга прозола. Промойте мембрану и TBST в течение 15 минут и дважды в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем повторно зондируйте мембраны с первичным антителом, чтобы метка стала pro.

Im следует соответствующее вторичное антитело. Визуализируйте PRO I и pro Im NNC путем детектирования хемилюминесценции для проверки идентичности полос, полученных в анализе наложения белковой мембраны. Взаимодействие между белками А и К и YFP и MP CYFP оценивали в эпидермальных клетках табака с помощью метода, описанного в этом видео, как показано здесь.

При оценке комплементации биомолекулярной флуоресценции был реконструирован сильный сигнал YFP. Этот сигнал BFC накапливается в Пунте на периферии клетки, что является диагностическим признаком de плазмы, поскольку МП является высоконерастворимым белком. При экспрессии в бактериях или растениях для подтверждения этого взаимодействия был принят анализ наложения белковой мембраны.

Белковые экстракты in vitro, содержащие один микрограмм GST MP или неслитый GST, растворяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле SDS с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Когда эти про иамы были исследованы растворимым стрептококком nnk и двумя GST mp, но не нерасплавленными, GST продемонстрировал связывание. Более того, когда тот же набор pro IMS был исследован с помощью неродственного pro saw nc IE Arabidopsis Cytoplasmic, NADH киназы помеченного стрептококком два, не наблюдалось связывания, что еще больше демонстрирует специфичность взаимодействия A NK MP. При попытке этой процедуры важно помнить о правильном пополнении иммобилизованных белков в соответствии с представленным протоколом.