Энциклопедия экспериментов JoVE
Исследования рака
0 просмотров • 3:17 мин. • April 30th, 2023
Измельчите опухолевую ткань на мелкие кусочки. Переложите кусочки в пробирку с буфером для разложения. Коллагеновые волокна, окружающие клетки, разрушаются, разрушая матрикс ткани. Затем измельчите переваренные кусочки и выбросьте большую часть буфера для разложения. Переверните трубку, чтобы разбить шарик.
Теперь решение состоит из скоплений клеток различного размера. Ресуспендируйте клеточные скопления в растворе трипсина и ингибитора ROCK. Трипсин продолжает разрушать опухоль, а ингибитор предотвращает гибель клеток. Через равные промежутки времени пипеткой вводите раствор, чтобы разбить комки и разогнать клетки. Затем ресуспендируют клетки в матричном растворе в соответствующей концентрации.
Поместите капли раствора в культуральную пластину, чтобы образовались матричные купола. Поместите пластины вверх дном в инкубатор и дайте матрице полностью застыть. Затем добавьте питательную среду для клеточных культур и инкубируйте лицевой стороной вверх. Матрица обеспечивает каркас для поддержки трехмерного роста органоида.
После измельчения поместите кусочки опухоли в 15-миллилитровую пробирку с буфером для пищеварения на 1,5-2 часа для переваривания при температуре 37 градусов Цельсия. В конце сбраживания осадите переваренную ткань с помощью центрифугирования и выбросьте надосадочную жидкость.
Переверните трубку, чтобы ослабить гранулу ячейки. Ресуспендируйте клетки в 1 миллилитре предварительно подогретого трипсина, дополненного 10 микромолярным ингибитором Y-27632 ROCK, в течение 5 минут при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации разотрите тканевую суспензию пять раз с помощью стандартного наконечника для пипетки P1000. Верните трубку на водяную баню для дополнительной 5-минутной инкубации и растирания.
Для матриксного купольного покрытия вымывают расщепленные клетки в 9 миллилитрах холодной среды, затем собирают клетки центрифугированием. Ресуспендируйте клетки в 1 миллилитр свежей среды для подсчета, а после подсчета снова соберите клетки центрифугированием. Разведите опухолевые клетки в соответствующем объеме матрикса.
Осторожно капните по 200 микролитров раствора матричных клеток в каждую лунку с температурой 55 градусов Цельсия на 6-луночной пластине. Дайте куполам застыть при комнатной температуре в течение 2 минут, прежде чем поместить пластину вверх дном в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 20 минут.
Когда купола полностью затвердеют, добавьте в каждую лунку по 2 миллилитра органоидной среды простаты с добавлением андрогена R1881 и ингибитора ROCK. Верните планшет в инкубатор для клеточных культур.