Иммунофлуоресцентная визуализация с помощью всего монтирования: метод фиксации и окрашивания для оценки интактных органоидов

Органоиды предстательной железы в первую очередь представляют собой внешний слой базальных эпителиальных клеток и внутренние слои люминальных эпителиальных клеток, расположенных вокруг центрального просвета.

Визуализация целиком позволяет изучать неповрежденные 3D-органоиды, сохраняя при этом их морфологию и гетерогенность. Чтобы начать окрашивание, обработайте органоиды подходящим фиксатором, чтобы зафиксировать их клеточные компоненты на месте, тем самым сохранив их. Промойте образец, чтобы удалить излишки фиксаторов.

Инкубируйте с коктейлем из блокирующего раствора и красителя, окрашивающего ДНК. Белки в блокирующем растворе пассивно связываются с неспецифическими участками клеток и уменьшают любое фоновое окрашивание. В то же время краситель, окрашивающий ДНК, окрашивает ядра клеток.

Добавьте два набора первичных антител, нацеленных на специфические антигены, экспрессируемые двумя составляющими клеточными популяциями. Инкубируйте с двумя различными вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями, которые связываются с первичными антителами. Промойте образец, чтобы удалить все несвязанные антитела.

Последовательно погружайте окрашенные органоиды в возрастающие концентрации растворов сахара, содержащего поверхностно-активные вещества, чтобы улучшить прозрачность тканей без ущерба для органоидной архитектуры. Такая обработка увеличивает глубину визуализации образца.

Установите органоиды на предметное стекло микроскопа с распорками, чтобы сохранить их 3D-морфологию во время визуализации. С помощью конфокального микроскопа можно наблюдать флуоресцентное излучение базальных и люминальных клеточных популяций, расположенных вокруг центрального просвета.

Чтобы выполнить иммунофлуоресцентное окрашивание органоидов предстательной железы в целом, сначала добавьте 500 микролитров 4% параформальдегида в PBS. Инкубируйте органоиды в течение 2 часов при комнатной температуре с легким встряхиванием. После стирки гранулы, как описано в текстовом протоколе, добавьте 1 микрограмм на миллилитр морилки DAPI в блокирующий раствор и выдерживайте в течение 2 часов при комнатной температуре. Защищайте образец от света во время инкубации с этого шага вперед. После центрифугирования органоидов, как и раньше, добавьте первичное антитело и блокирующий раствор и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с легким встряхиванием.

Еще раз измельчите органоиды и промойте гранулу с 1 миллилитром PBS в течение 15 минут с легким встряхиванием. Повторите эту процедуру стирки два раза. Затем добавьте вторичное антитело и блокирующий раствор и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия с легким встряхиванием. После инкубации измельчите органоиды и промойте гранулы еще два раза. Добавьте 1 миллилитр 30% сахарозы в PBS с 1% Triton X-100 к гранулированным органоидам. Затем выдерживайте в течение 2 часов при комнатной температуре с легким встряхиванием.

После повторного гранулирования органоидов добавьте 1 миллилитр 45% сахарозы в PBS с 1% Triton X-100 и аккуратно встряхните в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем повторите процедуру, за исключением добавления 1 миллилитра 60% сахарозы в PBS с 1% Triton X-100. Гранулируйте органоиды центрифугированием при 800 х г в течение 3 минут при комнатной температуре и удалите 95% надосадочной жидкости. Наблюдайте за гранулой под ультрафиолетовым светом, чтобы убедиться, что она не была потеряна во время удаления надосадочной жидкости. Гранулы становятся более рыхлыми, так как концентрация сахарозы становится выше. Перелейте от 10 до 20 микролитров оставшейся суспензии в камерный покровный стекло и приступайте к конфокальной микроскопии.