$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Фосфопептиды представляют собой короткие аминокислотные цепочки, содержащие фосфорилированные остатки серина, треонина или тирозина. Чтобы выделить фосфопептиды из пептидной смеси, начните с взятия шариков диоксида титана в пробирку. Уравновесьте для кондиционирования шариков с помощью подходящего подкисленного связующего буфера, содержащего закалочный агент. Добавьте нужную концентрацию пептидной смеси в кашицу для гранул.
Инкубируйте смесь при непрерывном встряхивании, чтобы бусины не оседали. Кислое состояние способствует образованию фосфатной группы фосфопептидов координатных связей с титановыми шариками. Гасящий агент в буфере уменьшает любое неспецифическое связывание нефосфорилированных пептидов с гранулами, оставляя их в суспензии.
Центрифуга для гранулирования связанных с фосфопептидом шариков, в то время как нефосфорилированные пептиды остаются в надосадочной жидкости. Выбросьте надосадочную жидкость. Перенесите связанные с фосфопептидом шарики в предварительно собранную колонну спинового фильтра. Центрифуга для удаления связывающего буфера и захвата конъюгированных фосфопептидом шариков.
Переложите фильтр в чистую трубку и добавьте раствор, содержащий аммиак. Аммиак превращает суспензию в основную, заставляя фосфопептиды отделяться от гранул. Центрифугируйте сборку для элюирования и сбора несвязанных фосфопептидов. Гранулы диоксида титана остаются в фильтрующем картридже. Высушите фосфопептиды, чтобы удалить любые следы аммиака.
Предварительно подготовьте диоксид титана с 500 микролитрами 100% ACN два раза. Затем смешайте диоксид титана с 500 микролитрами 0,2 М буфера фосфата натрия, pH 7, два раза. Наконец, используйте 300 микролитров уравновешивающего буфера, чтобы промыть бусины три раза. Добавьте 400 микролитров 50% ACN, 0,1% TFA в пробирку с низким уровнем связывания белка. Затем добавьте 84 микролитра молочной кислоты.
Перенесите ресуспендированные фосфопептиды в трубку с низким уровнем связывания белка и инкубируйте их при комнатной температуре с помощью вращателя «конец за концом» в течение 1 часа. После гранулирования шариков используйте 300 микролитров уравновешивающего буфера, чтобы промыть их два раза и открутить. С 300 микролитрами буфера для полоскания промойте шарики два раза. Затем переложите их в фильтр с отжимом 0,2 микрометра.
После отжима перенесите фильтрующий блок в чистую 1,5-миллилитровую трубку с низким связыванием белка и с 200 микролитрами 0,9% аммония в воде дважды разбавьте содержимое. После проверки рН вакуумируйте концентрат элюата до сухости на ночь, чтобы испарить аммиак.