Обогащение фосфопептидов на основе диоксида титана: метод селективного выделения фосфопептидов из пептидной библиотеки

Фосфопептиды представляют собой короткие аминокислотные цепочки, содержащие фосфорилированные остатки серина, треонина или тирозина. Чтобы выделить фосфопептиды из пептидной смеси, начните с взятия шариков диоксида титана в пробирку. Уравновесьте для кондиционирования шариков с помощью подходящего подкисленного связующего буфера, содержащего закалочный агент. Добавьте нужную концентрацию пептидной смеси в кашицу для гранул.

Инкубируйте смесь при непрерывном встряхивании, чтобы бусины не оседали. Кислое состояние способствует образованию фосфатной группы фосфопептидов координатных связей с титановыми шариками. Гасящий агент в буфере уменьшает любое неспецифическое связывание нефосфорилированных пептидов с гранулами, оставляя их в суспензии.

Центрифуга для гранулирования связанных с фосфопептидом шариков, в то время как нефосфорилированные пептиды остаются в надосадочной жидкости. Выбросьте надосадочную жидкость. Перенесите связанные с фосфопептидом шарики в предварительно собранную колонну спинового фильтра. Центрифуга для удаления связывающего буфера и захвата конъюгированных фосфопептидом шариков.

Переложите фильтр в чистую трубку и добавьте раствор, содержащий аммиак. Аммиак превращает суспензию в основную, заставляя фосфопептиды отделяться от гранул. Центрифугируйте сборку для элюирования и сбора несвязанных фосфопептидов. Гранулы диоксида титана остаются в фильтрующем картридже. Высушите фосфопептиды, чтобы удалить любые следы аммиака.

Предварительно подготовьте диоксид титана с 500 микролитрами 100% ACN два раза. Затем смешайте диоксид титана с 500 микролитрами 0,2 М буфера фосфата натрия, pH 7, два раза. Наконец, используйте 300 микролитров уравновешивающего буфера, чтобы промыть бусины три раза. Добавьте 400 микролитров 50% ACN, 0,1% TFA в пробирку с низким уровнем связывания белка. Затем добавьте 84 микролитра молочной кислоты.

Перенесите ресуспендированные фосфопептиды в трубку с низким уровнем связывания белка и инкубируйте их при комнатной температуре с помощью вращателя «конец за концом» в течение 1 часа. После гранулирования шариков используйте 300 микролитров уравновешивающего буфера, чтобы промыть их два раза и открутить. С 300 микролитрами буфера для полоскания промойте шарики два раза. Затем переложите их в фильтр с отжимом 0,2 микрометра.

После отжима перенесите фильтрующий блок в чистую 1,5-миллилитровую трубку с низким связыванием белка и с 200 микролитрами 0,9% аммония в воде дважды разбавьте содержимое. После проверки рН вакуумируйте концентрат элюата до сухости на ночь, чтобы испарить аммиак.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
• Connection to Experiment – The process of isolating and enriching phosphopeptides is central to this study.

• What is the role of phosphopeptides in a peptide mixture?
• How do titanium dioxide beads help in isolating phosphopeptides?
• What is the purpose of phosphopeptide enrichment kits in this experiment?

• Description of Practical Applications – Isolating phosphopeptides has broad applications in protein analysis and research (e.g., peptide mix).
• Identification of Industry Impact – This process is beneficial in various sectors that heavily rely on biochemistry and molecular biology (e.g., healthcare).
• Highlighting Societal Importance – Having a deeper understanding of protein analysis and research paves the way for biological advancements (e.g., sustainability).
• Link to Scientific Advancements – The innovative techniques used to isolate phosphopeptides helps advance our understanding of proteins.