Применение Microfluidics к электрофизиологии
1 октября 2007 г.
Меня зовут Дейв Эдингтон. Я доцент кафедры биоинженерии Иллинойсского университета в Чикаго. Основная область нашей работы — применение микротехнологий в биомедицине, в частности использование микрофлюидных устройств.
Сегодня мы продемонстрируем один из наших проектов, который предполагает использование микрофлюидного устройства, адаптированного под стандартную камеру для перфузии срезов мозга, что позволяет осуществлять пространственно-временную стимуляцию среза мозга. В настоящее время при электрофизиологических исследованиях на препаратах срезов основные способы нанесения нейротрансмиттеров на срез заключаются либо в глобальном воздействии на весь срез мозга целиком, когда мы стимулируем весь срез одновременно, либо в использовании микропипеты для точечного введения нейротрансмиттеров в разные моменты времени.
Срез мозга представляет собой очень сложную структуру, и при глобальном применении нейромедиаторов или использовании микропипетки невозможно воспроизвести паттерны стимуляции in vivo. В то время как с помощью нашей платформы мы можем контролировать стимуляцию очень специфических областей по всему срезу мозга и достигать стимуляции, более близкой к условиям in vivo. Здесь показаны современные перфузионные системы, которые стыкуются со стандартным предметным стеклом с покровным стеклом.
Это позволяет осуществлять перфузию среды через весь срез. Однако невозможно пространственно контролировать разрешение подачи нейромедиатора с помощью вашего стимулирующего устройства. Поэтому мы разработали микрофлюидное устройство, которое стыкуется с данной стандартной перфузионной камерой.
Таким образом, можно использовать все стандартные методы электрофизиологического анализа. Единственным отличием является то, что вместо стеклянного покровного стекла здесь используется устройство из PDMS с несколькими сквозными отверстиями, которые соединяются с микрофлюидными каналами. Эти каналы, в свою очередь, подключены к отверстиям в верхней перфузионной камере, через которые мы можем подавать нейротрансмиттеры: через отверстия, по каналам, через переходные отверстия и непосредственно в срез мозга. Для подачи жидкостей мы используем метод, называемый пассивным перекачиванием.
Таким образом, нам не требуются сложные системы трубок, выходящие из устройства, поскольку электрофизиология сама по себе является весьма трудоемкой процедурой. Упрощая конструкцию прибора и используя пассивную перекачку, мы упрощаем экспериментальный протокол применения данного микрофлюидного устройства. Структура устройства представляет собой двухслойную микрофлюидную сеть.
Первый слой представляет собой разводящие каналы, которые подключаются к выходным портам, а второй слой состоит из сквозных отверстий, соединяющих эти каналы с лункой. Данное изделие изготовлено с использованием стандартных этапов двухслойной микролитографии, при этом используются специальные метки совмещения, чтобы обеспечить расположение этих переходных отверстий точно по центру четырех каналов. Данное устройство предназначено для стыковки со стандартной камерой Profusion, что позволяет использовать все те же методы электрофизиологического анализа.
Таким образом, мы можем установить устройство на электрофизиологическую установку, совместить его с объективом, обеспечить локальную стимуляцию через микрофлюидные каналы и при этом избежать излишнего усложнения экспериментальной схемы. Благодаря максимально простому дизайну устройства, данную платформу будет гораздо легче распространять. В нашей текущей структуре в центре микрофлюидных каналов расположены четыре V-образных элемента, однако их конфигурацию можно адаптировать под нужды разных лабораторий в зависимости от того, какой отдел мозга они изучают.
Таким образом, в одной области можно изучать гиппокамп, а в другой — внешнюю кору. Мы можем стимулировать эти области в зависимости от конструкции данного микрофлюидного устройства. Поскольку устройство не требует внешних компонентов для работы, все, что вам понадобится — это микропипетка, чтобы вносить вещества в эти отверстия, используя метод пассивного перекачивания.
Для использования данного устройства стандартной электрофизиологической лаборатории не потребуется никакого дополнительного оборудования, помимо этого нижнего субстрата. До настоящего момента в рамках проекта мы фокусировались на состыковке микрофлюидных каналов со стандартными перфузионными камерами. Теперь следующей частью проекта станет тестирование устройства в реальных исследованиях на основе выдвинутых гипотез с использованием данных препаратов срезов.
Таким образом, мы продемонстрировали, что с помощью флуоресцентного красителя можно осуществлять пространственную стимуляцию различных областей, вводя эти флуоресцентные аналоги в каналы. Следующим шагом станет проведение полноценных биологических экспериментов. Таким образом, область микрофлюидики подходит к переломному моменту.
Мы переходим от этапа демонстрации новых концепций к реальному использованию этих устройств для совершения новых захватывающих открытий, которые ранее были невозможны. Таким образом, область развивается от методов, основанных на принципах микромасштаба, таких как быстрая диффузия, ламинарный поток, большое соотношение площади поверхности к объему и интеграция процессов, к их применению для решения актуальных проблем в лабораториях и клиниках.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье рассматривается применение микрофлюидных устройств в нейробиологии, в частности для пространственно-временной стимуляции срезов мозга. Этот метод повышает точность введения нейромедиаторов по сравнению с традиционными методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биоинженерия
- Микрофлюидика
Теоретическая справка
- В нейробиологии широко используются электрофизиологические препараты срезов тканей.
- Современные методы аппликации нейромедиаторов ограничены в точности.
- Микрофлюидные устройства предлагают новый подход к совершенствованию методов стимуляции.
- Стандартные камеры для перфузии срезов мозга могут быть модифицированы для улучшения их функциональности.
Цель исследования
- Продемонстрировать микрофлюидное устройство, позволяющее осуществлять пространственно-временную стимуляцию срезов мозга.
- Усовершенствовать метод введения нейромедиаторов при проведении электрофизиологических исследований.
- Обеспечить более контролируемую среду для экспериментов на срезах мозга.
Используемые методы
- Разработка микрофлюидного устройства, совместимого с камерами для перфузии срезов мозга.
- Применение нейромедиаторов с использованием микрофлюидной системы.
- Сравнение методов стимуляции: глобальной и локализованной.
- Электрофизиологические измерения для оценки эффективности стимуляции.
Основные результаты
- Микрофлюидное устройство обеспечивает точный контроль доставки нейромедиаторов.
- Пространственно-временная стимуляция демонстрирует лучшие результаты по сравнению с традиционными методами.
- Улучшенные результаты экспериментов на препаратах срезов мозга.
- Потенциал для более широкого применения в нейробиологических исследованиях.
Выводы
- Микрофлюидные устройства значительно улучшают процесс введения нейромедиаторов в срезы мозга.
- Данная технология может способствовать развитию электрофизиологических исследований и смежных областей.
- В будущих исследованиях могут быть изучены дополнительные возможности применения этого метода.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данная интеграция микрофлюидики и электрофизиологии решает ключевую нерешенную задачу в нейробиологических исследованиях: обеспечение пространственно и временно контролируемой доставки нейромодуляторов в срезы головного мозга. Благодаря возможности создания специфических для конкретных областей паттернов стимуляции, которые более точно имитируют условия in vivo, платформа повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижении рисков при изучении механизмов действия в программах разработки препаратов для ЦНС. Упрощенная конструкция с пассивным перекачиванием способствует широкому внедрению метода в рабочие процессы электрофизиологии без необходимости использования специализированной инфраструктуры.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы за счет точного пространственного контроля применения нейромодуляторов в определенных областях мозга.
- Практическая ценность: устраняет необходимость в манипуляциях с микропипетками, что снижает техническую вариабельность в экспериментах по доставке нейромедиаторов.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней путем воспроизведения более физиологически релевантных паттернов стимуляции по сравнению с глобальной перфузией.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет подготовить валидированные системы срезов мозга для последующего скрининга соединений путем разработки воспроизводимых протоколов локальной стимуляции.
- Количественные показатели: способствует измерению региональных электрофизиологических ответов, что позволяет проводить анализ «доза-эффект» и кинетический анализ.
- Повторное использование платформы: может быть адаптирована под разные области мозга (например, гиппокамп, кора) путем изменения конструкции микрофлюидных каналов, что поддерживает проведение кампаний по скринингу нескольких мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между этапами открытия и доклиническими исследованиями, предоставляя релевантную системе заболевания модель для тестирования эффектов нейромодуляторов в структурированной нервной ткани.
- Механистическое снижение рисков: позволяет прояснить специфические для конкретного пути эффекты препаратов посредством изолированной региональной стимуляции, что снижает неопределенность в исследованиях взаимодействия с мишенью.
- Прогресс с учетом рисков: дает основания для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), выявляя зависимость эффективности от региона и побочные сигналы на ранних этапах процесса поиска и оптимизации лекарственных средств.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс поиска лекарственных средств — от ранней валидации мишени до доклинической оценки, позволяя проводить исследования механизмов с пространственным разрешением, что повышает уверенность в выборе мишеней в ЦНС и оптимизации ведущих соединений.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов, позволяя изолировать независимые переменные (например, воздействие региональных нейромодуляторов) в сложных нейронных препаратах.
- Скрининг: повышает воспроизводимость анализов и точность количественных показателей благодаря стандартизированной подаче жидкости через микрофлюидные каналы с помощью пассивного насоса.
- Аналитика: позволяет получать специфические для конкретных условий электрофизиологические измерения, что дает возможность сравнивать региональные ответы, а также оценивать эффективность и селективность стимуляторов.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями, используя срезы мозга как релевантную при заболеваниях систему для оценки эффектов нейромодуляторов в условиях сохраненной архитектуры ткани.
- Корпоративное повторное использование: разработана как многоразовая платформа, совместимая со стандартными перфузионными камерами, что сводит к минимуму необходимость повторной валидации в различных лабораториях и проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет снижения механистической неоднозначности благодаря пространственно контролируемой стимуляции.
- Практическая ценность: улучшает воспроизводимость и масштабируемость за счет пассивной перекачки, исключая зависимость от внешних насосов или сложных систем трубок.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя проводить мультиплексный региональный анализ в рамках одной установки для электрофизиологии, что сокращает необходимость дублирования анализов.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков, предоставляя более четкие данные о зависимости «структура — активность» и взаимодействии с мишенью в различных подкорковых областях мозга.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с микрофлюидными устройствами и интеграцией электрофизиологических установок.
- Зависит от наличия стандартных камер для перфузии срезов мозга и систем микроскопической визуализации.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразного стыкования устройств и выравнивания каналов всеми пользователями.
- При воздействии на различные области мозга требуются корректировки в конструкции микрофлюидных переходов и компоновке каналов.
- Ограничено необходимостью проведения флуоресцентной или электрофизиологической валидации для подтверждения успешной доставки нейромодуляторов в целевые области.
