Биоинженерия правам микрососудистой сети в иммунодефицитных мышей

Общая цель данной процедуры заключается в создании сосудистой сети человека in vivo. Это достигается путем предварительного культивирования эндотелиальных клеток-предшественников, полученных из крови человека, и мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека. Затем оба типа клеток смешивают с гелем на основе коллагена, который вводят подкожно иммунодефицитной мыши.

Спустя семь дней имплантат извлекают и оценивают на предмет формирования человеческой сосудистой сети. В конечном итоге наличие специфических для человека микрососудов внутри имплантатов может быть подтверждено с помощью гистологии и иммуногистохимии. Главным преимуществом данной технологии перед традиционным методом, таким как хирургическая имплантация конструкта, является то, что она проста в исполнении и не требует хирургического вмешательства.

Начните с размораживания одного флакона E CFCs и немедленно разбавьте клетки в 15-мл конической пробирке, содержащей 10 мл DMEM. Центрифугируйте клеточную суспензию при 1200 RPM в течение пяти минут и ресуспендируйте клеточный осадок в 10 мл подогретой среды EGM two. Затем перенесите клетки в 100-мм планшет для культивирования тканей, покрытый 1% желатином, и инкубируйте клетки в течение ночи в увлажненном инкубаторе.

На следующее утро осторожно аспирируйте среду и все несвязавшиеся клетки. Затем добавьте связанным клеткам 10 миллилитров свежей среды E GM two. Повторяйте эту процедуру в течение следующих нескольких дней до формирования сплошного монослоя.

Затем промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Замените PBS двумя миллилитрами трипсина-ЭДТА и верните планшет в инкубатор на пять минут. По истечении пяти минут, глядя в микроскоп, осторожно постучите по планшету и проверьте, открепились ли клетки.

Если нет, повторите краткие инкубации при осторожном покачивании. После полного открепления клеток добавьте к ним 8 мл среды EGM two и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте количество клеток и центрифугируйте их при 1200 об/мин в течение пяти минут.

Теперь высейте клетки на планшеты для культивирования тканей, покрытые 1% желатином, с плотностью посева 5 000 клеток на квадратный сантиметр. Инкубируйте клетки в среде EGM two и проводите их подкормку средой EGM two каждые два-три дня. Повторяйте эту процедуру для последующих пассажей с четвертого по восьмой.

Клетки E CFC будут готовы к использованию. Данный протокол также может быть использован для культивирования МСК. В этом случае замените среду E GM two на среду M-S-C-G-M.

Используйте культуральную пластину без покрытия. Начинайте субкультивирование при достижении 80% конфлюэнтности и проводите пересев с плотностью посева 10 000 клеток на квадратный сантиметр. Для данного эксперимента требуется 800 000 E CFCs и 1 200 000 MSCs на один имплантат.

Как правило, пять имплантатов подготавливают одновременно. Для начала аспирируют питательную среду из культуральных чашек и промывают каждую чашку с клетками 10 milliliters PBS. Заменяют PBS на two milliliters трипсина-EDTA и инкубируют чашки при осторожном покачивании.

Контролируйте состояние клеток под микроскопом каждые две-пять минут до полного открепления всех клеток. Затем добавьте 8 мл DMEM и соберите клеточную суспензию. В конической пробирке объемом 15 мл подсчитайте количество клеток и перенесите количество клеток, достаточное для пяти имплантатов, в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл.

Затем центрифугируйте клетки при 1200 об/мин в течение пяти минут и удалите супернатант. Осторожно приготовьте на льду смесь фибриногена и коллагенового фибронектина. Затем очень аккуратно ресуспендируйте осадок клеток в охлажденной смеси.

Избегая образования пузырьков воздуха, перенесите суспензию клеток в шприц объемом 1 мл и установите иглу 26-го калибра с колпачком. Храните заполненный шприц на льду до момента инъекции клеточной смеси. Четырех шестинедельных атимических голых иммунодефицитных мышей подвергли анестезии в камере с изофлураном.

После того как мыши будут анестезированы и перестанут реагировать на щипок за палец, приступайте к инъекциям для каждой мыши. С помощью иглы 30-го калибра подкожно введите 50 µL растворов тромбина в верхнюю часть спины. В то же место введите 200 µL смеси клеток.

При использовании иглы 26-го калибра введенные макромолекулы подвергнутся гелеобразованию, в результате чего под кожей образуется небольшой, но заметный бугорок. После инъекции поместите мышей на слой марли для обеспечения комфорта и тепла. Наблюдайте за ними до тех пор, пока они не восстановят способность передвигаться.

В течение следующих трех дней ежедневно наблюдайте за общим состоянием здоровья животного. Через одну неделю после инъекций подвергните мышей эвтаназии с помощью диоксида углерода и хирургическим путем извлеките гелевую пробку. После извлечения сфотографируйте гелевые пробки рядом с линейкой, затем поместите каждую пробку в гистологическую кассету и погрузите их в 10% нейтральный буферный формалин на ночь при комнатной температуре.

На следующий день промойте 10% нейтральный буферный формалин дистиллированной водой. Храните кассеты в PBS при температуре четырех градусов Цельсия до проведения гистологического анализа. Изготовьте срезы имплантата, залитого в парафин, толщиной семь микрон.

Затем количественно определите плотность микрососудов в средней части имплантатов. С помощью окрашивания гематоксилином и эозином подсчитайте количество сосудов на квадратный миллиметр, чтобы подтвердить человеческое происхождение микрососудов. Окрасьте срезы с использованием коммерчески доступных антител к человеческому CD 31 в разведении 1:100.

На данном изображении, полученном методом фазово-контрастной микроскопии, видна характерная «булыжная» морфология эндотелиальных клеток в типичном конфлюэнтном монослое eCFC, полученных из пуповинной крови. На этом изображении представлена типичная веретеновидная морфология МСК, полученных из костного мозга человека. После недельной инкубации в организме мыши-хозяина имплантат, отмеченный желтой пунктирной линией, при большем увеличении выглядел существенно иначе, чем ткани хозяина.

Были обнаружены многочисленные микрососуды, просветы которых содержат эритроциты; они отмечены желтыми стрелками. При иммуногистохимическом исследовании пластов просветы микрососудов оказались реактивны к моноклональным антителам к человеческому CD 31. Ядра клеток были докрашены гематином.

При должном владении этой технологией процедуру можно выполнить в объеме одной унции, если соблюдать все правила.