Биоинженерия правам микрососудистой сети в иммунодефицитных мышей

Общая цель этой процедуры заключается в создании сосудистой сети человека in vivo. Это достигается путем культивирования эндотелиальных колониеобразующих клеток, полученных из человеческой крови, и мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека. Затем оба типа клеток смешиваются в гель на основе коллагена, который вводится подкожно мыши с иммунодефицитом.

Через семь дней имплантат извлекается и оценивается на предмет формирования сосудистой сети человека. В конечном счете, наличие специфических для человека микрососудов внутри имплантатов может быть проверено с помощью его гистологии и иммуногистохимии. Основным преимуществом данной технологии перед таким кислотным методом, как хирургическая имплантация конструкции, является то, что светодиод прост и удобен в исполнении, а также не требует хирургического вмешательства.

Начните с размораживания одного флакона Е ХФУ и немедленно разведите клетки в 15-миллилитровом коническом, содержащем 10 миллилитров DMEM. Уменьшите клеточную суспензию при 1200 об/мин в течение пяти минут и Ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах теплой среды EGM two. Затем перенесите клетки в 100-миллиметровую тканевую культуральную пластину, покрытую 1% желатином, и инкубируйте клетки в течение ночи во влажном инкубаторе.

На следующее утро аккуратно отсасывайте среду и все несвязанные клетки. Затем накормите связанные клетки 10 миллилитрами свежей Е ГМ двух сред. Продолжайте этот процесс в течение следующих нескольких дней, пока не образуется сливающийся монослой.

Затем промойте клетки 10 миллилитрами PBS. Замените ПБС двумя миллилитрами трипсин в ЭДТА и верните тарелку в инкубатор на пять минут. Через пять минут под микроскопом аккуратно постучите по пластине и проверьте, не оторвались ли клетки.

Если нет, повторите короткие инкубации с легким покачиванием. Как только клетки полностью отделятся, добавьте к клеткам восемь миллилитров EGM двух сред и переложите ячейки в коническую форму объемом 15 миллилитров. Посчитайте ячейки и вращайте их со скоростью 1200 оборотов в минуту в течение пяти минут.

Теперь поместите клетки на планшеты для культуры тканей, покрытые 1% желатином, с плотностью посадки 5000 клеток на квадратный сантиметр. В среде EGM two инкубируйте клетки и подкармливайте их каждые два-три дня средой EGM two. Повторите эту процедуру для последующих отрывков между четвертым и восьмым отрывками.

Е ХФУ будут готовы к использованию. Этот протокол также может быть использован для выращивания МСК. Просто замените E GM two medium на M-S-C-G-M medium.

Используйте культуральную пластину без покрытия. Начинайте субкультуру при 80%-ном слиянии и субкультуру при плотности посева 10 000 клеток на квадратный сантиметр. Для этого эксперимента требуется 800 000 E CFC и 1 200 000 MSC на имплантат.

Как правило, одновременно изготавливается пять имплантатов. Для начала отсадите клеточную среду из культивальных планшетов и промойте каждую пластину клеток 10 миллилитрами PBS. Замените PBS двумя миллилитрами трипсина ЭДТА и инкубируйте планшеты с легким покачиванием.

Проверяйте клетки под микроскопом каждые две-пять минут, пока все клетки не отделятся. Затем добавьте восемь миллилитров DMEM и соберите клеточный раствор. В конусе объемом 15 миллилитров подсчитайте ячейки и перенесите достаточное количество клеток для пяти имплантатов в одну коническую камеру объемом 15 миллилитров.

Затем раскрутите ячейки со скоростью 1200 об/мин в течение пяти минут и удалите сна. Тщательно приготовьте смесь фибриногена и коллагена фибронектина на льду. Затем очень аккуратно суспендируйте клеточную гранулу в ледяную смесь.

Не допуская образования пузырьков воздуха, загрузите клеточную суспензию в одномиллилитровый шприц и прикрепите к нему иглу 26 калибра с колпачком. Держите заряженный шприц на льду до тех пор, пока не будет введена клеточная смесь. Обезболили четырех шестинедельных гипотетических обнаженных мышей с иммунодефицитом с помощью фторсодержащей камеры ISO.

Как только мыши обезболятся и перестанут реагировать на защемление пальцев ног, приступайте к инъекциям для каждой мыши. С помощью иглы 30 калибра введите 50 микролитров растворов тромбина подкожно в верхнюю дорсальную область. В это же место вводят 200 микролитров клеточной смеси.

С помощью иглы 26 калибра введенные макромолекулы слипаются и образуют небольшой, но заметный бугорок под кожей. После инъекции поместите мышей на слой марли для комфорта и тепла. Наблюдайте за ними до тех пор, пока они не станут амбулаторными.

В течение следующих трех дней проводите ежедневное наблюдение за общим состоянием здоровья животного. Через неделю после инъекций усыпьте мышей углекислым газом и хирургическим путем удалите гелевую пробку. После извлечения сфотографируйте гелевые пробки рядом с линейкой, затем поместите каждую гелевую пробку в гистологическую кассету и погрузите их в 10% нейтральный буферизованный формин на ночь при комнатной температуре.

На следующий день смойте 10% нейтральный буферный формин дистиллированной водой. Храните кассеты в PBS при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут оценены для гистологической оценки. Сделайте семимикронные участки имплантата погруженными в парафин.

Затем количественно оцените плотность микрососудов в средней части имплантатов. С помощью оценки по окрашиванию H и e количество сосудов на квадратный миллиметр демонстрирует человеческую природу микрососудистых сосудов. Окрашивайте срезы коммерчески доступным античеловеческим антителом CD 31 в разведении 1 к 100.

На этом изображении фазового контраста показана характерная булыжная морфология эндотелиальных клеток в типичном сливающемся монослое ХФУ, полученных из пуповинной крови. На этом изображении показана типичная морфология веретенообразной формы МСК, полученных из костного мозга человека. После недельной инкубации у мыши-хозяина имплантат, отмеченный желтой пунктирной линией, выглядел совсем иначе, чем ткани хозяина при более высоком увеличении.

Выявлены множественные микрососуды, их световые структуры, содержащие эритроциты и выделены желтыми стрелками. При иммуногистохимическом исследовании пробок просвет микрососудов был реакционноспособным к моноклональному антителу к CD 31 человека. Ядра клеток подвергались противодействию гематину.

После освоения эта технология может быть реализована в течение одной унции, если она выполнена правильно.