Крыса Брыжейка Ангиогенез Пробирной

Добро пожаловать в отделение патологии университетской клиники GaN в Гуттенбурге, Швеция. Я доктор Клаус Норби, и метод, который вы сейчас увидите, был разработан в моей лаборатории. Клинически значимый ангиогенез, который возникает в связи с гипоксией, солидными опухолями или любым другим заболеванием, сопровождающимся ангиогенезом, происходит почти исключительно в нативно васкуляризированных тканях. У взрослых мелких грызунов брыжейка, соединяющая тонкий кишечник с задней стенкой полости тела, содержит ряд тонких перепончатых участков. У крыс таких «мезентериальных окон» насчитывается от 40 до 50. Они практически прозрачны и поэтому при визуальном осмотре напоминают окна; у взрослых самцов крыс каждое такое окно окружено жировой тканью.

Брюшинные окна (мезентериальные окна) изначально васкуляризированы и не обладают измеримым физиологическим ангиогенезом. Таким образом, они предоставляют возможность изучать ангиогенез de novo в васкуляризированных тканях взрослых млекопитающих. То есть, инициацию полноценного ангиогенного ответа с нуля, преодолевая действие эндогенных ингибиторов ангиогенеза, которые работают в тестируемой ткани, как и во всех нормальных тканях у мышей; при этом во многих окнах отсутствуют собственные микрососуды, которые могли бы служить родительскими микрососудами, что, к сожалению, делает данный анализ в его естественной форме непредсказуемым у мышей.

Брыжеечные окна у взрослых крыс обычно содержат относительно небольшое количество мелких кровеносных сосудов, расположенных на периферии. Толщина этих брыжеечных окон в естественном состоянии составляет всего от 5 до 10 мкм. Это позволяет распределять неповрежденную ткань по предметным стеклам и исследовать ее микроскопически, что дает возможность наблюдать все сосуды в каждом окне и придает сосудам фактически двумерную протяженность.

Данный метод предоставляет уникальную возможность проводить количественные измерения пространственного распространения, плотности, особенностей формирования паттерна и размера микрососудов. Подкожная локализация популярна в исследованиях ангиогенеза, однако из-за гетерогенности эндотелиальных клеток и специфических свойств тканей контроль ангиогенеза в подкожных тканях и в растущих подкожно опухолях может не предсказывать контроль ангиогенеза и метастазирования в висцеральных органах, таких как легкие, печень, кости и мозг. Это заслуживает внимания, так как висцеральные метастазы обычно в конечном итоге становятся причиной летального исхода при раке.

Тот факт, что мезентериальное окно является висцеральным, должен быть преимуществом в этом отношении. Целью нашего проекта является количественное изучение аспектов ангиогенеза de novo. Для этого мы вводим внутрибрюшинно известный проангиогенный фактор или исследуемое вещество.

Обычно мы вводим по пять миллилитров за один раз взрослым крысам без анестезии. Такой объем быстро подвергает воздействию вводимой жидкости весь брыжеечный мезальтерий. Любой раствор, введенный внутрибрюшинно, при условии, что его объем не является минимальным, должен воздействовать на все клетки исследуемой ткани, тем более что слой мезотелиальных клеток, покрывающий чрезвычайно тонкое брыжеечное окно, обладает высокой проницаемостью для растворенных веществ. Поскольку хирургическое вмешательство не требуется, ангиогенез, изучаемый в брыжеечном окне, не подвергается влиянию ангиогенеза, индуцированного заживлением ран, поэтому ангиогенная терапия проводится в виде внутрибрюшинных инъекций.

По практическим соображениям мы используем протокол лечения, включающий две ежедневные инъекции в течение пяти дней — с утра понедельника по утро пятницы, что является стандартом при изучении ангиогенных эффектов определенных белков, таких как, например, VEGF 1 65, 1 64 и основной FGF. В качестве растворителя обычно используется инфузионный раствор Pharmacia. Количество процедур может показаться большим, однако было показано, что индуцировать статистически значимый ангиогенез не всегда возможно даже при использовании таких мощных проангиогенных факторов, как VEGF и основной FGF, если они вводятся в одной дозе или несколькими разнесенными во времени дозами в приблизительно физиологических концентрациях; следует помнить, что в тканях действуют мощные эндогенные ингибиторы ангиогенеза.

Применение терапевтических методов модуляции ангиогенеза имитирует клиническую терапевтическую ситуацию. Один или несколько факторов, модулирующих ангиогенез, могут вводиться системно, подкожно, внутривенно или перорально. Например.

Это имитирует ситуацию клинического лечения, так как позволяет изучать эффект не только исходной молекулы, но и ее метаболитов. Данная система обеспечивает определенную степень контроля токсических эффектов системно вводимых агентов, модулирующих ангиогенез. Поскольку взрослые крысы физиологически растут и могут набрать вес примерно на 40% за время эксперимента продолжительностью две или три недели, путем взвешивания животных можно определить степень, в которой лечение замедлило увеличение массы тела, что может быть расценено как проявление токсических эффектов.

Это позволяет выявить токсические дозы при проведении тестов по модуляции ангиогенеза, которых следует избегать. Это имеет важное значение, так как в противном случае может быть невозможно интерпретировать результаты с точки зрения специфических антиангиогенных эффектов. Поскольку взрослые крысы растут значительно быстрее, чем взрослые мыши, влияние токсических агентов на прирост массы тела должно быть более чувствительным индикатором общих токсических эффектов у крыс, чем у мышей.

Теперь мы продемонстрируем вам способ изготовления препаратов брыжеечных окон. Животные были усыплены с помощью CO2. Брыжеечные окна распределены по обычным предметным стеклам размером 3 на 1 дюйм, начиная с дистальных отделов брыжейки.

Ангиогенез в брыжеечном окне невозможно наблюдать невооруженным глазом, начиная от илеоцекального клапана и двигаясь в ретроградном направлении. Используются четыре окна, отобранные из наиболее дистальной части брыжейки. Образец на предметном стекле высушивают при комнатной температуре в течение 20 минут.

Остаток кишечника отсекают. Затем образцы хранят в морозильной камере при температуре -20 °C. Таким образом образцы могут храниться в течение нескольких месяцев или даже лет без заметного ухудшения качества.

Окрашивание проводят с использованием моноклональных антител к эндотелию крысы. Образец оставляют высыхать на воздухе; накрытие стеклом не используют. Количественную оценку частоты встречаемости кровеносных сосудов в отдельных окнах брыжейки проводят с помощью компьютерной морфометрической микроскопии на рисующем микроскопе с общим оптическим увеличением от 14 до 34. Визуализируется все окно брыжейки.

Увеличение выбирается с фиксированным шагом так, чтобы образцом было охвачено как можно большее поле зрения. Вся область окна легко визуализируется, поскольку граница между окном и окружающей жировой тканью четко выражена. Затем все васкуляризированные части отрисовываются в соответствии со строго определенными критериями.

Можно четко различить даже самые маленькие вновь образованные кровеносные сосуды, диаметр которых при большом увеличении составляет примерно 2.5–3.0 µm. Тот факт, что средний диаметр эритроцита крысы равен или превышает 6.3 µm, наглядно демонстрирует, насколько малы эти сосуды. Площадь всех васкуляризированных участков в окне, выраженная в процентах от общей площади окна, называется относительной васкуляризированной площадью va.

Фактически это измерение пространственного расширения сосудов, поскольку они обладают, по сути, двумерным расширением; например, VA можно легко измерить с помощью компьютерной телеметрии. Следующий этап включает регистрацию плотности микрососудов и характера формирования паттернов в трех центральных частях васкуляризированных областей каждого окна. Эти участки выбираются систематически случайным образом при оптическом увеличении 80.

Каждый сосуд визуализируется в виде одной линии с помощью рисующего микроскопа. Изображение каждого поля зрения передается в виде цифрового изображения в анализатор изображений, после чего каждый сосуд на цифровом изображении приводится к толщине в один пиксель. Затем прибор измеряет количество пикселей, представляющих сосуды, и выражает это значение как доля от общего количества пикселей в поле зрения.

Этот процентный показатель, длина микрососудов или MVL, представляет собой длину микрососудов на каждую единицу васкуляризированной области и является комплексным показателем плотности микрососудов. При перемножении среднего значения VA для четырех окон на одно животное на средний показатель MVL для соответствующей группы лечения вычисляется общая длина микрососудов на одно животное, TMVL. Кроме того, нами были разработаны методы детального количественного анализа плотности и состава микрососудов с использованием анализа изображений.

К ним относятся измерение фактического расстояния между двумя последовательными микрососудами, точками ветвления, т. е. длины отдельных микрососудов, сегментов LEMS, количества микрососудов, сегментов на единицу объема ткани, NOMS, и количества точек ветвления микрососудов на единицу объема ткани, NOBP. Степень извитости микрососудов MVT определяется разницей между кратчайшим и фактическим расстоянием между двумя последовательными точками ветвления; также учитываются случаи пересечения микрососудов (индекс пересечения INIS) и формирование взаимосвязанных петель. Индекс формирования петель INLF также может быть точно измерен с использованием аналогичных методов на периферии сети микрососудов.

Мы также можем количественно определить соответствующие переменные для ростков, включая длину ростков, LESP, и количество ростков на единицу объема ткани, NOSP, при планировании экспериментов, поскольку могут наблюдаться значительные различия между животными в одной группе лечения и даже между брыжеечными окнами у одного и того же животного. Мы обнаружили, что практической может оказаться следующая схема: количество животных в группе лечения в период наблюдения — от 8 до 12, количество окон на одно животное, анализируемых с точки зрения VA, количество полей зрения для каждого окна, анализируемого по длине микрососудов, MVL, длине сегментов микрососудов, LEMS, количеству сегментов микрососудов, NOMS, количеству точек ветвления микрососудов, NOBP, извилистости микрососудов, MVT, индексу пересечений I, индексу образования петель INF; в качестве контроля используются три животных, получавших плацебо (носитель). Анализ ангиогенеза в брыжеечном окне хорошо подходит для исследований зависимости эффекта от дозы и для кинетического анализа ангиогенеза.

Это можно осуществить путем введения группам животных различных доз проангиогенного фактора и последующего забива этих животных в разные моменты времени в ходе ангиогенного ответа. Таким образом в количественном выражении можно дифференцировать экспансивную фазу, пик и последующую ангиорегрессивную фазу. Исследования такого рода показали, что ангиогенный ответ de novo на любой протестированный цитокин фактора роста специфически зависит от дозы с точки зрения скорости, силы и продолжительности.

Более того, характер формирования новых сосудов с точки зрения пространственного распространения и изменений плотности микрососудов зачастую демонстрирует выраженную дозо- и временную зависимость по сравнению с ангиогенезом, опосредованным VEGF или основным FGF при приблизительно физиологических дозах. Ангиогенез, опосредованный мастоцитами (MCMA), индуцированный путем селективной активации мастоцитов in situ, характеризуется значительно более высокой активностью и заметно большей продолжительностью. Фактически, ангиогенез, опосредованный мастоцитами, был впервые описан с использованием данного метода анализа благодаря возможности количественно оценивать объективные переменные ангиогенеза, высокой биологической релевантности системы и возможности проверки токсичности воздействия.

Данная методология уникально подходит для анализа зависимости «структура — активность» и «доза — ответ». Модель MWAA у крыс представляет собой систему для изучения ангиогенеза во взрослой нативно васкуляризированной висцеральной ткани, в которой отсутствует физиологический ангиогенез и которая не подвергается хирургическому воздействию, что позволяет исключить любое влияние ангиогенеза, индуцированного заживлением ран. Этот анализ является действительно количественным и точно оценивает ряд биологически значимых объективных переменных, описывающих пространственное распространение, плотность и характер формирования микрососудов.

Данный анализ хорошо подходит для изучения системных эффектов ангиогенеза, модулирующих факторов, а также для исследований зависимости «структура — активность» и «доза — ответ». Методика, описанная здесь, была разработана в лаборатории доктора Клосса Карла Норби на кафедре патологии Университетской больницы Река, при Университете Борг в Гётеборге, Швеция. Все исследования в рамках этого проекта были поддержаны Шведским медицинским исследовательским советом, номер проекта 5 9 4 2.

Выражается искренняя благодарность за квалифицированную техническую помощь г-же Ган Эффер, которая принимала участие в проекте с самого его начала, г-же Монике Андерсон (отсутствует) и г-же Энн Немар Линдгрен.

Надеюсь, что эта краткая презентация позволила вам оценить потенциал данного метода анализа. Если вы будете использовать этот анализ в своей лаборатории, я буду рад помочь вам в случае возникновения каких-либо технических проблем. Кроме того, я буду очень признателен за любые ваши предложения.

Спасибо.