Immunohistochemistry: Парафин частей с помощью Vectastain ABC Kit Векторные Labs

Здравствуйте, меня зовут Виктор Чи, я аспирант лаборатории Чанди на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. Сегодня я продемонстрирую, как окрашивать срезы, залитые парафином, с использованием набора A b, C от Vector Laboratories. Эта процедура включает в себя депарафинизацию и гидратацию срезов, проведение термоиндуцированного восстановления антигенов для их демаскировки, блокировку пероксидазы и неспецифического связывания белков, инкубацию с CD four, тирозингидроксилазой и вторичными антителами, а также проявление и заключание препарата на предметном стекле.

Итак, приступим. Поскольку препараты залиты парафином, первым шагом является депарафинизация стекол. Обычно эта процедура проводится в вытяжном шкафу с использованием трех банок с ксилолом; каждая из трех промывок длится пять минут.

Затем предметные стекла помещают в 100% этанол. Вы заметили, что воск на стеклах исчез, но будьте осторожны и не прикасайтесь к стеклам в перчатках, так как ксилол растворяет резину перчаток. После этого стекла, находясь в 100% этаноле, переносят обратно в лабораторию, где они пройдут через градиент гидратации.

Теперь я расскажу вам о градиенте гидратации, через который мы будем проводить наши препараты. Сначала они проходят через две ванны со 100% этанолом. После этого мы переносим препараты в две ванны с 95% этанолом.

Затем мы переносим предметные стекла в одну ванночку с 70% ethanol, а оттуда — в ванночку с 50% ethanol. После этого мы переносим стекла в 30% ethanol, и через две минуты переносим их в дважды дистиллированную воду. После обработки дважды дистиллированной водой мы оставляем предметные стекла в PBS.

Теперь я продемонстрирую, как переносить предметные стекла из одной ванны в другую с помощью кассет. Первым шагом, используя держатель для кассет, извлеките стекла и осторожно промокните их, чтобы удалить излишки жидкости и не переносить слишком много раствора в следующую ванну. После этого погрузите их в раствор и подождите две минуты до следующего изменения градиента.

Зачастую при фиксации тканей антиген маскируется, что препятствует связыванию с ним антитела. Поэтому сейчас я продемонстрирую метод восстановления антигена с помощью нагрева с использованием цитрата натрия. Сейчас мы находимся у микроволновой печи, где я буду проводить демаскировку антигена CD8, который я планирую обнаружить методом иммуногистохимии.

Теперь я добавлю раствор и помещу его в микроволновую печь на 15 минут. Таким образом, мы будем кипятить цитрат натрия вместе со слайдами в течение 15 минут, чтобы предотвратить высыхание слайдов. Мы будем следить за процессом, чтобы при закипании и выкипании раствора доливать цитрат натрия для поддержания гидратации слайдов.

Перед тем как поместить предметные стекла в раствор цитрата натрия, я предварительно прогреваю его в течение 45 секунд. Затем я помещаю стекла в цитрат натрия и нагреваю раствор в течение 15 минут. При наличии в нем стекол раствор обычно начинает кипеть примерно через две-две с половиной минуты после начала процесса кипячения.

В этот момент я остановлю процесс и заменю израсходованный цитрат натрия свежим раствором цитрата натрия. После кипячения цитрата натрия в течение 15 минут необходимо извлечь предметные стекла с раствором и охладить их. Лучший способ сделать это — закрыть держатель для стекол крышкой, слить излишки жидкости и промыть его под струей холодной воды до тех пор, пока раствор внутри контейнера не остынет до комнатной температуры.

Обычно это занимает от 10 до 15 минут. После того как мы достанем предметные стекла из раковины, нам необходимо заблокировать активность эндогенной пероксидазы в тканях. Для этого мы приготовим раствор перекиси водорода, используя 30% hydrogen peroxide для получения 1% hydrogen peroxide раствора.

Затем я переношу стекла напрямую в раствор перекиси водорода. Теперь мы будем инкубировать стекла в перекиси водорода в течение 20 минут. По истечении 20 минут, после блокирования эндогенной пероксидазы, я промою стекла от перекиси водорода, используя раствор PBS.

Теперь я перенесу предметные стекла в каретку и промою их трижды, по пять минут за каждую промывку. Эти стекла были размещены «спина к спине», чтобы избежать контакта с другими стеклами, который может повредить ткань. Я аккуратно сдвигаю стекла и располагаю их так, чтобы ткань не могла соприкоснуться со стеклом.

Затем мы переносим предметные стекла в PBS. После промывки стекол раствором PBS я приступлю к блокировке неспецифического связывания белков с помощью раствора, содержащего 5% BSA, 5% сыворотки козы и 0,1% азида натрия. Если вы используете антитела к козе, сыворотку козы следует заменить сывороткой другого вида.

Сейчас я помещу предметные стекла в держатель и заполню его раствором. Обычно я заполняю его наполовину, чтобы при добавлении стекол ткани оказались полностью погружены в жидкость. При помещении стекол в контейнер важно следить за тем, чтобы ткани не касались его стенок.

Для последнего слайда поверните его внутрь, чтобы ткань не касалась контейнера. Теперь, когда слайды выдерживались в блокирующем растворе в течение ночи, я удалю излишки этого раствора, промыв их трижды по 5 минут в PBS. На данном этапе необходимо обвести ткань кругом из жидкого блокировщика, чтобы минимизировать количество используемых антител.

Если вам не нужно экономить антитела, вы можете инкубировать предметные стекла в тех же кюветах, в которых проводился этап блокировки. Далее я покажу вам, как обводить образец ткани жидким блокирующим агентом. Для начала удалите излишки жидкости, стараясь не касаться ткани.

Просто протрите углы, чтобы удалить излишки жидкости. Снова будьте очень, очень осторожны, чтобы не касаться ткани. Возьмите штифт для блокировки жидкости, осторожно нажмите на него, чтобы запустить поток, и после этого обведите ткань ручкой.

Дайте жидкому блокирующему раствору высохнуть в течение примерно 15 секунд. На этом этапе необходимо добавить первичные антитела. С помощью пипетки равномерно нанесите первичные антитела на ткань, после чего поместите её в камеру с контролируемой влажностью.

Для этого мы используем салфетку Kimwipe, смоченную дистиллированной водой в данном контейнере, чтобы предотвратить высыхание предметного стекла во время инкубации с первичными антителами. Теперь, когда первичные антитела инкубировались в течение одного часа, мы достанем предметные стекла и смоем излишки антител с помощью PBS.

Снова просто дайте жидкости стечь и поместите образец в раствор PBS для промывки. Повторите промывку три раза по пять минут. После трех пятиминутных промывок мы добавим вторичное антитело к ткани таким же образом, как добавляли первичное антитело.

Используя объем, достаточный для покрытия тканей, добавьте вторичный антитело (в данном случае мы используем козьи антитела к кроличьим) и поместите предметное стекло обратно в камеру с контролируемой влажностью. Мы используем биотинилированные вторичные козьи антитела к кроличьим, что крайне важно при применении метода ABC. Перенесите предметное стекло в камеру с контролируемой влажностью и оставьте для инкубации на один час.

Пока происходит инкубация с вторичным антителом, необходимо подготовить реагент ABC. Мы используем реагент ABC компании Vector Laboratories из набора Vector Stain. Извлеките реагент А, подготовьте его и добавьте три капли в 15 мл PBS, стараясь не сжимать пробирку, так как капли должны быть строго дозированы и иметь определенный размер.

После того как вторичные антитела инкубировались в течение примерно одного часа, возьмите предметные стекла и снова промойте их в PBS, как вы делали это с первичными антителами. После трех промывок продолжительностью по пять минут каждая перенесите стекла в этот контейнер, куда вы добавите реагент A B, C, приготовленный за 30–45 минут до начала. Просто добавьте реагент A B, C сюда, полностью погрузите стекла и оставьте их для инкубации еще на 30–45 минут.

После того как ваши препараты выдержали в растворе A, B, C около 3–5 минут, необходимо смыть избыток этого раствора. Для этого извлеките препараты и поместите их в раствор PBS. Эту процедуру промывки в PBS следует повторить трижды, выдерживая препараты по пять минут при каждой промывке.

Пока стекла промываются, я готовлю субстрат пероксидазы DAB от Vector Laboratories. Я беру буфер с pH 7.5 и добавляю два капли. После буфера с pH 7.5 я беру реагент субстрата DAB и добавляю две капли этого реагента.

Повторим, размер капли имеет решающее значение, поэтому не сжимайте флакон, а просто дайте каплям свободно скапать. Две капли буфера pH 7.5. Затем добавьте четыре капли реагента субстрата DAB, также позволяя им свободно скапать.

В конце также следует добавить две капли реагента-субстрата перекиси водорода. Таким образом должна выглядеть смесь реагента-субстрата DAB. Теперь её можно наносить на стекла: извлеките стекла и дайте PBS просто стечь с них.

Со временем реагент DAB приобретает более коричневый оттенок. Поэтому на данном этапе его следует добавить на стекла. Возьмите объем, достаточный для покрытия тканей, и нанесите его непосредственно на образцы тканей.

Возьмите необходимый объем раствора и нанесите его непосредственно на образцы тканей; дайте раствору прореагировать, так как со временем ткани должны окраситься в коричневый цвет. После добавления раствора DAB на данном срезе мозга можно увидеть, что ткань становится коричневой здесь и здесь. Коричневое окрашивание DAB выявляет область, содержащую дофаминергические нейроны среднего мозга.

После проявления предметных стекол в течение от двух до 10 минут необходимо поместить их в ледяную воду, чтобы остановить реакцию. Слейте раствор и перенесите предметные стекла непосредственно в ледяную воду. После погружения стекол в ледяную воду перенесите ванночку к раковине и промывайте ее под проточной холодной водой в течение примерно пяти минут, чтобы полностью удалить раствор DAB из ванночки.

Поэтому при помещении в раковину будьте осторожны: не допускайте попадания струи воды непосредственно на ткань; направьте ее в один из углов так, чтобы вода просто переливалась, чтобы поток воды не потревожил ваши срезы. После извлечения предметных стекол из промывочного раствора необходимо провести докрашивание. Зачем может потребоваться докрашивание?

Во-первых, это может понадобиться для того, чтобы рассмотреть структуру ткани. Во-вторых, чтобы визуализировать все клетки. Поэтому для наших целей мы проведем докрашивание гематоксилином, который выявляет ядра.

Теперь нам нужно взять предметные стекла, удалить излишки жидкости и один раз погрузить их в раствор гематина. После этого извлеките стекла и сразу поместите их в воду. Поместив стекла в водопроводную воду, промойте их под струей воды, как вы делали ранее с ледяной водяной баней.

Для промывки гематоксилином просто держите препарат под проточной водой до тех пор, пока вода внутри стакана не станет прозрачной. После извлечения из воды докрашенных предметных стекол необходимо провести их повторное обезвоживание. Для этого следует снова пройти через градиент этанола, но в обратном порядке.

Таким образом, следует провести одну промывку деионизированной водой, одну промывку 30% ethanol, одну промывку 50% ethanol, одну промывку 70% ethanol, две промывки 95% ethanol и две промывки 100% ethanol; каждая стадия промывки должна длиться две минуты. Извлеките предметные стекла, удалите излишки жидкости и перенесите их непосредственно в 30% ethanol, выдержав в течение двух минут. После последней промывки в 100% ethanol предметные стекла необходимо вернуть в ксилол.

Снова возьмите предметные стекла, удалив излишки жидкости, и поместите их в первый ксилол на пять минут. Таким образом, будет проведено три последовательных промывки ксилолом по пять минут каждая. Теперь мы готовы к заключению препаратов на предметных стеклах.

Обычно я поступаю следующим образом: за одну минуту до готовности предметных стекол я набираю в пастер-пипетку раствор для перманентного закрепления и выдерживаю его примерно одну минуту, пока стекла не будут готовы к извлечению. После последней промывки ксилолом, стараясь не погружать перчатки в ксилол и не допускать их намокания, извлеките стекла пинцетом, обращая внимание на то, с какой стороны находится ткань. Осторожно удалите излишки ксилола салфеткой Kimwipe, стараясь не касаться ткани; аккуратно протрите только углы и края, позволяя большей части ксилола испариться. Вероятно, вы успеете обработать два стекла до того, как первое из них высохнет.

После того как один предметный слайд высохнет, другой должен быть готов к работе. Теперь с ними нужно работать до того, как они полностью высохнут. Нанесите тонкую линию Perimount рядом с тканью, стараясь не касаться самого образца ткани.

Удалите перемаウント, снимая покровное стекло. Приложите его под углом 45 градусов и плавно опустите. Затем сдвиньте покровное стекло, убедившись, что перемаウント полностью покрывает все ткани.

Затем положите его и осторожно нажмите в центре, чтобы удалить все лишние пузырьки воздуха. Дайте ему высохнуть, пока работаете со вторым образцом ткани; сейчас еще не время изучать стекла. Нам необходимо дать пермамонту высохнуть в течение ночи перед тем, как приступать к просмотру стекол.

В противном случае при рассмотрении под микроскопом в перманентномmounting-средстве появятся пузырьки воздуха, и образец будет испорчен. Перед вами срезы мозга после окрашивания химическими реагентами и кроличьими поликлональными антителами к тирозингидроксилазе. Коричневое окрашивание DAB снова указывает на расположение дофаминергических нейронов среднего мозга.

Докрашивание гематином окрашивает все ядра в данной ткани в синий цвет. Таким образом, я продемонстрировал вам способ окрашивания срезов, залитых парафином, с использованием набора ABC от Vector Laboratories. Теперь вам следует скорректировать условия в зависимости от типов тканей, которые вы будете окрашивать, и используемых антител.

Желаем вам удачи в проведении экспериментов.