Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Общая цель данной процедуры заключается в селекции паразитов Plasmodium falciparum, способных связываться с эндотелиальными клетками головного мозга человека. Это достигается путем первоначального инкубирования культуры паразитов Plasmodium falciparum, содержащей смесь инфицированных и неинфицированных эритроцитов, с слоем эндотелиальных клеток головного мозга человека; на следующем этапе неинфицированные и несвязанные эритроциты удаляются путем многократного промывания культуральной средой. Затем добавляются свежие эритроциты для обеспечения дальнейшего роста популяции паразитов.

Заключительный этап через несколько недель заключается в повторении общего отбора, как только будет достигнуто достаточное количество паразитов. В конечном итоге используется микроскопия для демонстрации высокого количества паразитов, связанных с HBE five i. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области церебральной малярии, такие как идентификация лигандов паразитов или молекул рецепторов хозяина, участвующих в процессе цитоадгезии.

Подготовьте эритроциты человека из цельной крови группы O(I) положительной, отделив эритроциты от лейкоцитов путем пропускания крови через лейкоцитный фильтр. Центрифугируйте клетки при 1000 G в течение 10 минут и ресуспендируйте осадок в неполной среде PMI.

Повторите этот этап промывки еще раз, затем повторно суспендируйте осадок. В нашей неполной среде PMI с гематокритом 50% эритроциты хранятся при температуре четыре градуса Цельсия в течение недели. Культивируйте эритроциты, инфицированные Odium Valspar.

Добавьте полную среду RPMI при гематокрите 2% и инкубируйте ежедневно при 37 °C в атмосфере с 3% carbon dioxide, 1% oxygen и 96% nitrogen. Приготовьте мазок Гемса для оценки стадии развития паразитов. Ежедневно заменяйте среду, центрифугируя культуру при 500 G в течение пяти минут.

Примерно раз в неделю аспирируйте супернатант и добавляйте свежую полную среду RPMI. Синхронизируйте паразитов путем обработки 5% водным раствором сорбитола. Селективный анализ можно проводить на следующий день после того, как в культуре на стадии кольца будет наблюдаться минимум 5%–10% паразитемии.

Кроме того, на одну чашку диаметром 60 мм с клетками hbe five eye требуется достаточное количество культуры паразитов для формирования объема P-клеток 30 µL. Подготовьте чашку для культивирования тканей диаметром 60 мм для посева линии микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека или H back fivei, добавив в чашку фибронектин в концентрации 2 µg/cm² и стерильный физраствор.

Инкубируйте чашку при 37 °C от 5 до 20 минут, затем аспирируйте раствор фибронектина. Затем соберите клетки HBE five I из тканевого флакона площадью 25 см² путем трионизации и центрифугирования, суспендируйте осадок клеток в 10 мл полной среды DMEM. Затем добавьте 1,5 мл этой клеточной суспензии в чашку для культивирования тканей, обработанную фибронектином, и инкубируйте при 37 °C и 5% CO₂ в течение двух-трех дней, пока культура не достигнет 50–100% конфлюэнтности; после этого культуры будут готовы к цитокинин-анализу в день проведения исследования.

Культура HBE five I должна иметь конфлюэнтность от 50 до 100%. Культура паразитов должна находиться на стадии пигментированных трофозоитов с содержанием паразитов не менее 5-10% и гематокритом 2%. Сначала отберите пипеткой 1,5 мл культуры паразитов из флакона и перенесите в центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Центрифугируйте культуру при 500 G в течение пяти минут и повторно суспендируйте в 10 миллилитрах свежеприготовленной подогретой неполной среды DMEM. Повторите этот этап промывки второй раз после завершения финального центрифугирования.

Растворите осадок объемом 30 µL в 1,5 mL неполной среды DMEM, дополненной 1% BSA. Затем возьмите 60-миллиметровую чашку с hvac.Five.

Аспирируют культуральную среду из клеток глаза и дважды промывают их тремя миллилитрами неполной среды DMEM. Добавляют суспензию паразитов в чашку с клетками HPE-5 и инкубируют в инкубаторе для культивирования тканей в общей сложности 75 минут.

Дважды во время инкубационного периода ресуспендируйте паразитов, осторожно покачивая и вращая чашку после инкубации. Промойте чашку пять раз, аспирируя среду пластиковой паста-пипеткой и добавляя по 3 mL теплой неполной среды DMEM; после окончательного промывания осторожно покачайте планшет и изучите содержимое чашки под инвертированным микроскопом. Если все еще видно много неинфицированных эритроцитов, повторите процедуру промывки, описанную выше, чтобы удалить их.

После аспирации среды из чашки суспендируйте 40 µL плотно упакованного объема свежих эритроцитов в подогретой полной среде RPMI и добавьте клеточную суспензию в чашку. Поместите чашку в герметичную инкубационную камеру. Затем продуйте содержимое чашки смесью 3% углекислого газа, 1% кислорода и 96% азота в течение трех минут.

Поместите камеру в инкубатор при 37 °C на ночь. В течение этого периода инкубации паразиты на стадии шизонта разрываются, и мерозоиты повторно инфицируют эритроциты. На следующий день соберите паразитов на стадии кольца путем промывки.

С помощью неполного среды RPMI аналогичным образом, как и прежде, но с более интенсивным пипетированием среды и покачиванием планшета. Соберите всю использованную среду, содержащую ресуспендированные эритроциты, в коническую пробирку объемом 15 мл. Осмотрите планшет под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться, что все эритроциты были удалены из центрифугируемого планшета.

Пробирку, содержащую среду с промытой планшета для осаждения паразитов, центрифугируют, после чего супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 5 мл полной среды RPMI и переносят смесь в квадратный флакон объемом 25 см для культивирования. Паразитов культивируют от двух до четырех недель до получения достаточного количества материала для проведения нового раунда селекции.

Неотобранные паразиты HB three демонстрируют низкий уровень связывания с клетками hbe five eye. На данном изображении представлены клетки hbe five eye, фиксированные 2% глютаральдегидом и окрашенные по методу Гимзы, визуализированные под микроскопом при 1000-кратном увеличении; снимки были сделаны после вымывания неинфицированных эритроцитов и несвязанных инфицированных эритроцитов. После каждого раунда селекции всё больше и больше паразитов связываются с эндотелиальными клетками, и селекцию можно повторять с более короткими временными интервалами после пяти раундов отбора.

Популяции паразитов с высокой связывающей способностью были получены, как показано здесь, с помощью паразитов HB three HBE. В данной таблице представлен сводный перечень штаммов plasmodium alspar, которые были успешно отобраны для связывания с HE five. Отмечу, что HB three также был отобран на TNF-активированных HE five I после пяти раундов селекции.

Штамм DD two не показал увеличения связывания с HBE five I по сравнению с неселектированным DD two. На данном изображении при 400-кратном увеличении показано связывание паразитов plasmodium alspar HB three с дермальными эндотелиальными клетками HD MEK до проведения селекции. Здесь показано связывание паразитов plasmodium alspar HB three с той же линией дермальных эндотелиальных клеток после четырех раундов селекции.

На данном рисунке показано связывание паразитов Plasmodium spar HB3 с легочными эндотелиальными клетками HPME до проведения селекции. После четырех раундов селекции связывание паразитов Plasmodium spar HB3 с клетками H HPME увеличилось. Несмотря на небольшие различия в питательной среде для hd e, C и H HP EC, протокол селекции был идентичен протоколу для hbe five I. После выполнения этой процедуры можно использовать такие методы, как RT-PCR или микроанализ, для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, для характеристики транскрипции вариабельных поверхностных антигенов у неселектированных и селектированных паразитов.