Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов
13 ноября 2011 г.
Профилирование экспрессии РНК дискретных областей мозга мыши требует точной и повторяемой стратегии сбора тканей. Здесь описан протокол, в котором используется как корональное сечение мозга, так и микродиссекция с помощью пробков. Выход и качество общей РНК, полученные из полученных образцов, подтверждают полезность описанного метода.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы собрать общую РНК из дискретных ядер мозга повторяемым, последовательным, экономически эффективным и не содержащим РНК способом. Это достигается путем подготовки рабочей среды, свободной от RN, и удаления всего мозга из обезглавленной мыши. Затем измельчитель тканей с микрометрическим управлением используется для резки серийных срезов тканей одинакового размера.
Затем интересующие области мозга микрорассекаются с использованием тканевого ядра заданного диаметра, сохраняя при этом ткань в среде, свободной от РНК. Наконец, общая РНК выделяется из иссеченных ядер мозга. В конечном итоге могут быть получены результаты, которые показывают достаточный выход и качество общей РНК для подготовки библиотеки CDNA и профилирования транскриптома с помощью фотометрических спектров или флюорометрических анализов.
Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как грубая анатомия или иссечение области мозга с помощью лазерной микроскопии, заключается в том, что несколько дискретных областей мозга, представляющих интерес, могут быть собраны из отдельного мозга мыши воспроизводимым и достаточно экономичным способом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, могут ли различные профили экспрессии транскриптов в областях мозга, не связанных с нейронными цепями, коррелировать с определенными поведенческими чертами, реакциями окружающей среды и/или состоянием болезни. Чтобы подготовиться к микродиссекции, дополните 100 миллилитров сбалансированного раствора соли Эрла или EBSS 0,44 грамма бикарбоната натрия и 0,884 грамма глюкозы.
Обработайте EBSS 0,1 миллилитрами DEPC в автоклавируемом флаконе или колбе с завинчивающейся крышкой в течение не менее 12 часов. При 37 градусах по Цельсию. Поместите стеклянные пипетки объемом пять и три четверти дюйма в литровый стеклянный стакан и поместите кисти художника щетиной вверх в стеклянный градуированный цилиндр объемом 100 миллилитров.
Добавьте достаточное количество раствора воды, обработанной DEPC, чтобы покрыть пипетки и щетки. Накройте стакан и градуированный цилиндр алюминиевой фольгой и инкубируйте не менее 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия после 12-часовой инкубации с DEPC, нагрейте все обработанные DEPC материалы до температуры более 100 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут. Классно. EBSS при комнатной температуре перед хранением при температуре четыре градуса Цельсия.
Вылейте DD H2O из стакана и градуированного цилиндра и продолжайте инкубировать их при температуре более 100 градусов Цельсия, пока материалы не высохнут. Достаньте их из инкубатора, охладите до комнатной температуры и храните для последующего использования. В день эксперимента обработайте все рабочие поверхности для удаления загрязненных РНК места и поддерживайте EBSS на водяной бане, установленной при температуре 40 градусов Цельсия, для буферизации и насыщения кислородом.
EBSS проникает в него 5% CO2 и 95% кислорода, помещая газовую трубку в пастбищную пипетку без РНК. А вставив пипетку в ЭБСС, закройте отверстие контейнера ЭБСС. Настройте тканевый срез для серийного среза мозговой ткани.
Обработайте верхнюю и нижнюю поверхности тканевого слайсера. Чтобы удалить загрязнение РНК, приложите прямоугольный кусок ватмана No четыре, фильтрующую бумагу к поверхности измельчителя тканей. Прикрепите обоюдоострое лезвие бритвы к рычагу измельчителя.
Установите микрометр на ноль и отрегулируйте минимальную высоту рычага измельчителя так, чтобы лезвие бритвы могло резать фильтровальную бумагу, но не пластину из плексигласа. Соберите все дополнительные материалы, необходимые для микродиссекции, в том числе чашки для клеточных культур без РНК размером 60 на 15 мм, тканевые наконечники для микропипеток с содержанием 200 микролитров РНК, изогнутые ножницы, сухой лед и пробирки для сбора тканей. Поместите трубки на сухой лед после обезглавливания мыши с помощью гильотины для грызунов и удаления всего мозга с неповрежденными задними и зрительными нервами.
Поместите мозг в верхнюю часть чашки для культуры свободных клеток размером 60 на 15 миллиметров. Затем перенесите его на рабочую поверхность для отбора проб ткани. Используйте пипетку, не содержащую РНК, для консервативного увлажнения фильтровальной бумаги, прикрепленной к измельчителю тканей, с помощью EBSS.
Смочите ткани мозга с помощью EBSS. Перенесите мозг в измельчитель тканей и расположите его так, чтобы вентральная поверхность лежала на фильтровальной бумаге. Срединная линия перпендикулярна лопасти измельчителя и ростральный край мозга, примыкающий к лезвию.
Используйте кисть художника, обработанную A-D-E-P-C, чтобы удерживать мозг в неподвижном состоянии, оказывая легкое давление на тыльную поверхность мозга, удерживая мозг в неподвижном состоянии. Поднимите рычаг держателя лезвия примерно на четыре-пять сантиметров над поверхностью тыльной ткани и удерживайте его в таком положении. Снимите щетку с поверхности мозга и наберите 750 микрометров.
С помощью микрометра. Дайте рычагу опуститься, измельчая ткань и создавая корональное сечение 750 микрометров, в то время как лезвие измельчителя остается неподвижным. Раскатистыми движениями кисти художника аккуратно смахните участок ткани от поверхности лезвия.
Немедленно поместите срез ткани в насыщенный кислородом ЭБСС в чашке Петри. Теперь этот срез готов к микродиссекции. Повторяйте процедуру среза до тех пор, пока не будут получены серийные срезы мозга по всей плоскости росткодала для проведения микродиссекции.
Во-первых, проверьте освещение, чтобы убедиться, что образец освещения не будет заблокирован. Отрегулируйте положение и поток смеси O2 и CO2 для поддержания буферной кислородной среды для тканей. Во время процедуры определите корональный отдел мозга, который включает в себя интересующую область, и с помощью кисти художника расположите его плашмя на дне чашки Петри.
Выберите тканевый стержень с подходящим диаметром. Удерживайте участок корональной ткани на месте с помощью кисти художника и опустите режущий кончик сердцевины ткани вниз по поверхности участка ткани. Оказывая давление, надавите на кончик ядра ткани через тканевую секцию и плотно опуститесь на дно чашки Петри.
Используйте вращающиеся круговые движения, чтобы убедиться, что интересующая область была диссоциирована от окружающих тканей. Осторожно оторвите сердцевину ткани от участка ткани и освободите микропуансон, позволяя ему плавать в EBSS с помощью кисти художника. Немедленно поместите микродырокол для тканей в пробирку для хранения с температурой минус 80 градусов Цельсия, хранящуюся на сухом льду.
Ткань должна легко прилегать к боковой стороне трубки. Верните пробирку, содержащую микрообразец, в сухой лед. Повторите эту микродиссекцию для каждой интересующей вас области мозга.
После завершения микродиссекции запишите соответствующую этикетку или штрих-коды для каждого образца, содержащего пробирку. Поместите образцы тканей в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия до извлечения РНК для извлечения РНК из образцов тканей. Во-первых, подготовьте рабочее пространство, свободное от РНК.
Приготовьте достаточное количество смеси магнитных шариков и раствора для связывания лизиса, как описано в руководстве по набору для выделения всей РНК. Достаньте образцы тканей из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия и поместите пробирки прямо на сухой лед. Добавьте 100 микролитров раствора для связывания лизиса в пробирку с образцом.
Прикрепите пестик размером 0,5 миллилитровой трубки без нуклеазы к смесителю для гранул и гомогенизируйте ткань с помощью наконечника пипетки без нуклеазы с низким удержанием. Немедленно перенесите гомогенизированный образец в лунку на круглом дне 96 луночного планшета для культивирования тканей с использованием наконечника того же типа. Добавьте в образец 60 микролитров 100% изопропанола.
Добавьте 20 микролитров смеси для гранул в образец и перемешайте пипетированием вверх и вниз три-четыре раза. Следуйте протоколу набора для выделения полной РНК Шаги для завершения полной экстракции РНК. Наконец, измерьте чистоту и концентрацию полученной общей РНК Данные о микроударах различных областей мозга приведены в этой таблице.
Образцы РНК, содержащие 30 микролитров эволюционного буфера, обеспечивают достаточное количество общей РНК для использования с коммерчески доступными продуктами для получения CD NA для секвенирования РНК. Кроме того, выход РНК и два соотношения 60 к двум 80 являются одиночными значениями, полученными из соответствующих образцов микродиссекции для демонстрации показаний, полученных из каждой области мозга, и они подтверждают высокую чистоту образца. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что риск загрязнения РНК рабочих поверхностей или образцов тканей сведен к минимуму, используя только материалы, не содержащие РНК или обработанные dsy.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эта статья описывает протокол для профилирования экспрессии РНК в дискретных областях мозга мыши, акцентируя внимание на точной и повторяемой стратегии сбора ткани. Метод сочетает коронару секцию мозга с микродиссекцией с помощью ядерного щипца для получения высококачественной общей РНК.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Молекулярная биология
- Профилирование РНК
Предпосылки
- Профилирование экспрессии РНК важно для понимания функций мозга.
- Дискретные ядра мозга требуют тщательной диссекции для точного анализа.
- Поддержание без-РНКазной среды важно для целостности РНК.
- Предыдущие методы не обладали стабильностью и повторяемостью.
Цель исследования
- Установить надежный протокол для извлечения РНК из областей мозга мыши.
- Обеспечить высокий выход и качество РНК для последующих приложений.
- Облегчить профилирование транскриптома путем улучшения методов сбора ткани.
Использованные методы
- Подготовка без-РНКазной рабочей среды.
- Обезглавливание и удаление всего мозга из мыши.
- Равномерное секционирование ткани мозга с использованием тканерезки с микрометром.
- Микродиссекция целевых областей мозга с использованием ядерного щипца в без-РНКазной среде.
Основные результаты
- Быль получен высокий выход общей РНК из диссецированных ядер мозга.
- Качество РНК было подтверждено как пригодное для подготовки библиотеки комплементарной ДНК.
- Результаты подтверждают полезность метода для профилирования транскриптома.
- Ассаи продемонстрировали достаточное качество РНК для последующих приложений.
Выводы
- Описанный протокол обеспечивает надежный подход для извлечения РНК.
- Он повышает стабильность и качество образцов РНК из областей мозга мыши.
- Этот метод полезен для будущих исследований в области нейробиологии, включающих анализ РНК.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This microdissection approach enables reproducible, high-yield total RNA isolation from discrete mouse brain regions, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where low RNA yields from laser capture microscopy hinder transcriptome profiling. By providing consistent RNA quality suitable for next-generation sequencing, the method supports mechanistic de-risking of CNS targets and improves predictive confidence in early discovery workflows. It positions as a scalable, cost-efficient alternative for brain region-specific gene expression studies in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating RNA from specific brain nuclei to correlate transcript expression with neuronal circuit function and behavioral phenotypes.
- Operational Value: Provides repeatable, cost-efficient sample collection from multiple discrete regions per mouse, reducing animal use and increasing throughput for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers total RNA with sufficient yield and purity for downstream RNA-Seq and qRT-PCR, enabling reliable assay development for gene expression screening in brain tissue models.
- Operational Value: Uses magnetic bead-enabled RNA isolation compatible with high-throughput workflows, supporting standardization across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant transcriptomic profiling in mouse models, aligning with translational biomarker discovery efforts in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Ensures RNA integrity through RNase-free protocols, improving reproducibility in longitudinal preclinical studies and cross-laboratory data comparability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, where precise brain region RNA profiling informs target selection and prioritization before preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling transcriptomic comparison across discrete brain regions linked to specific neural circuits.
- Screening: Produces standardized RNA inputs suitable for quantitative gene expression screening, enhancing reproducibility in target engagement assays.
- Analytics: Generates high-quality RNA for spectrophotometric and fluorometric quantification, enabling precise input normalization for sequencing and PCR-based applications.
- Translational Research: Connects discovery-phase expression profiling to preclinical continuity by providing disease-relevant transcriptomic data from defined brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue collection and RNA isolation platform applicable across multiple neuroscience projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise brain region-specific expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via RNase-free workflows and minimal hands-on time (8–10 minutes per sample).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling multiple regional samples from a single animal, reducing costs associated with low-yield methods requiring amplification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering reliable transcriptome data for go/no-go decisions in CNS drug discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and RNase-free technique to maintain sample integrity during dissection and RNA extraction.
- Depends on access to a micrometer-operated tissue chopper, set-diameter tissue corers, and magnetic bead-based RNA isolation kits.
- Necessitates standardized RNase-free environment protocols across teams to ensure cross-study consistency in RNA quality.
- Adaptation to other brain regions or species may require optimization of tissue core diameter and sectioning parameters.
- Practical limitation: Manual tissue punching may limit ultra-high-throughput applications compared to automated laser capture systems, though it offers superior RNA yield.
