Номера для лазерной микроскопии Захват подход к микродиссекция дискретных областей мозга мыши для полной изоляции РНК и переработки нового поколения Секвенирование и профилирование экспрессии генов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы собрать общую РНК из дискретных ядер мозга повторяемым, последовательным, экономически эффективным и не содержащим РНК способом. Это достигается путем подготовки рабочей среды, свободной от RN, и удаления всего мозга из обезглавленной мыши. Затем измельчитель тканей с микрометрическим управлением используется для резки серийных срезов тканей одинакового размера.

Затем интересующие области мозга микрорассекаются с использованием тканевого ядра заданного диаметра, сохраняя при этом ткань в среде, свободной от РНК. Наконец, общая РНК выделяется из иссеченных ядер мозга. В конечном итоге могут быть получены результаты, которые показывают достаточный выход и качество общей РНК для подготовки библиотеки CDNA и профилирования транскриптома с помощью фотометрических спектров или флюорометрических анализов.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как грубая анатомия или иссечение области мозга с помощью лазерной микроскопии, заключается в том, что несколько дискретных областей мозга, представляющих интерес, могут быть собраны из отдельного мозга мыши воспроизводимым и достаточно экономичным способом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, могут ли различные профили экспрессии транскриптов в областях мозга, не связанных с нейронными цепями, коррелировать с определенными поведенческими чертами, реакциями окружающей среды и/или состоянием болезни. Чтобы подготовиться к микродиссекции, дополните 100 миллилитров сбалансированного раствора соли Эрла или EBSS 0,44 грамма бикарбоната натрия и 0,884 грамма глюкозы.

Обработайте EBSS 0,1 миллилитрами DEPC в автоклавируемом флаконе или колбе с завинчивающейся крышкой в течение не менее 12 часов. При 37 градусах по Цельсию. Поместите стеклянные пипетки объемом пять и три четверти дюйма в литровый стеклянный стакан и поместите кисти художника щетиной вверх в стеклянный градуированный цилиндр объемом 100 миллилитров.

Добавьте достаточное количество раствора воды, обработанной DEPC, чтобы покрыть пипетки и щетки. Накройте стакан и градуированный цилиндр алюминиевой фольгой и инкубируйте не менее 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия после 12-часовой инкубации с DEPC, нагрейте все обработанные DEPC материалы до температуры более 100 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут. Классно. EBSS при комнатной температуре перед хранением при температуре четыре градуса Цельсия.

Вылейте DD H2O из стакана и градуированного цилиндра и продолжайте инкубировать их при температуре более 100 градусов Цельсия, пока материалы не высохнут. Достаньте их из инкубатора, охладите до комнатной температуры и храните для последующего использования. В день эксперимента обработайте все рабочие поверхности для удаления загрязненных РНК места и поддерживайте EBSS на водяной бане, установленной при температуре 40 градусов Цельсия, для буферизации и насыщения кислородом.

EBSS проникает в него 5% CO2 и 95% кислорода, помещая газовую трубку в пастбищную пипетку без РНК. А вставив пипетку в ЭБСС, закройте отверстие контейнера ЭБСС. Настройте тканевый срез для серийного среза мозговой ткани.

Обработайте верхнюю и нижнюю поверхности тканевого слайсера. Чтобы удалить загрязнение РНК, приложите прямоугольный кусок ватмана No четыре, фильтрующую бумагу к поверхности измельчителя тканей. Прикрепите обоюдоострое лезвие бритвы к рычагу измельчителя.

Установите микрометр на ноль и отрегулируйте минимальную высоту рычага измельчителя так, чтобы лезвие бритвы могло резать фильтровальную бумагу, но не пластину из плексигласа. Соберите все дополнительные материалы, необходимые для микродиссекции, в том числе чашки для клеточных культур без РНК размером 60 на 15 мм, тканевые наконечники для микропипеток с содержанием 200 микролитров РНК, изогнутые ножницы, сухой лед и пробирки для сбора тканей. Поместите трубки на сухой лед после обезглавливания мыши с помощью гильотины для грызунов и удаления всего мозга с неповрежденными задними и зрительными нервами.

Поместите мозг в верхнюю часть чашки для культуры свободных клеток размером 60 на 15 миллиметров. Затем перенесите его на рабочую поверхность для отбора проб ткани. Используйте пипетку, не содержащую РНК, для консервативного увлажнения фильтровальной бумаги, прикрепленной к измельчителю тканей, с помощью EBSS.

Смочите ткани мозга с помощью EBSS. Перенесите мозг в измельчитель тканей и расположите его так, чтобы вентральная поверхность лежала на фильтровальной бумаге. Срединная линия перпендикулярна лопасти измельчителя и ростральный край мозга, примыкающий к лезвию.

Используйте кисть художника, обработанную A-D-E-P-C, чтобы удерживать мозг в неподвижном состоянии, оказывая легкое давление на тыльную поверхность мозга, удерживая мозг в неподвижном состоянии. Поднимите рычаг держателя лезвия примерно на четыре-пять сантиметров над поверхностью тыльной ткани и удерживайте его в таком положении. Снимите щетку с поверхности мозга и наберите 750 микрометров.

С помощью микрометра. Дайте рычагу опуститься, измельчая ткань и создавая корональное сечение 750 микрометров, в то время как лезвие измельчителя остается неподвижным. Раскатистыми движениями кисти художника аккуратно смахните участок ткани от поверхности лезвия.

Немедленно поместите срез ткани в насыщенный кислородом ЭБСС в чашке Петри. Теперь этот срез готов к микродиссекции. Повторяйте процедуру среза до тех пор, пока не будут получены серийные срезы мозга по всей плоскости росткодала для проведения микродиссекции.

Во-первых, проверьте освещение, чтобы убедиться, что образец освещения не будет заблокирован. Отрегулируйте положение и поток смеси O2 и CO2 для поддержания буферной кислородной среды для тканей. Во время процедуры определите корональный отдел мозга, который включает в себя интересующую область, и с помощью кисти художника расположите его плашмя на дне чашки Петри.

Выберите тканевый стержень с подходящим диаметром. Удерживайте участок корональной ткани на месте с помощью кисти художника и опустите режущий кончик сердцевины ткани вниз по поверхности участка ткани. Оказывая давление, надавите на кончик ядра ткани через тканевую секцию и плотно опуститесь на дно чашки Петри.

Используйте вращающиеся круговые движения, чтобы убедиться, что интересующая область была диссоциирована от окружающих тканей. Осторожно оторвите сердцевину ткани от участка ткани и освободите микропуансон, позволяя ему плавать в EBSS с помощью кисти художника. Немедленно поместите микродырокол для тканей в пробирку для хранения с температурой минус 80 градусов Цельсия, хранящуюся на сухом льду.

Ткань должна легко прилегать к боковой стороне трубки. Верните пробирку, содержащую микрообразец, в сухой лед. Повторите эту микродиссекцию для каждой интересующей вас области мозга.

После завершения микродиссекции запишите соответствующую этикетку или штрих-коды для каждого образца, содержащего пробирку. Поместите образцы тканей в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия до извлечения РНК для извлечения РНК из образцов тканей. Во-первых, подготовьте рабочее пространство, свободное от РНК.

Приготовьте достаточное количество смеси магнитных шариков и раствора для связывания лизиса, как описано в руководстве по набору для выделения всей РНК. Достаньте образцы тканей из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия и поместите пробирки прямо на сухой лед. Добавьте 100 микролитров раствора для связывания лизиса в пробирку с образцом.

Прикрепите пестик размером 0,5 миллилитровой трубки без нуклеазы к смесителю для гранул и гомогенизируйте ткань с помощью наконечника пипетки без нуклеазы с низким удержанием. Немедленно перенесите гомогенизированный образец в лунку на круглом дне 96 луночного планшета для культивирования тканей с использованием наконечника того же типа. Добавьте в образец 60 микролитров 100% изопропанола.

Добавьте 20 микролитров смеси для гранул в образец и перемешайте пипетированием вверх и вниз три-четыре раза. Следуйте протоколу набора для выделения полной РНК Шаги для завершения полной экстракции РНК. Наконец, измерьте чистоту и концентрацию полученной общей РНК Данные о микроударах различных областей мозга приведены в этой таблице.

Образцы РНК, содержащие 30 микролитров эволюционного буфера, обеспечивают достаточное количество общей РНК для использования с коммерчески доступными продуктами для получения CD NA для секвенирования РНК. Кроме того, выход РНК и два соотношения 60 к двум 80 являются одиночными значениями, полученными из соответствующих образцов микродиссекции для демонстрации показаний, полученных из каждой области мозга, и они подтверждают высокую чистоту образца. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что риск загрязнения РНК рабочих поверхностей или образцов тканей сведен к минимуму, используя только материалы, не содержащие РНК или обработанные dsy.