Отслеживание Деформации Морфогенетические тканей в раннем куриного эмбриона

Общая цель представленных здесь методов заключается в маркировке и культивировании эмбриональных тканей для измерения морфогенетической деформации в ходе раннего развития. Для культивирования раннего эмбриона цыпленка начните с извлечения эмбриона из яйца с помощью метода переноса на фильтровальной бумаге. В зависимости от целей эксперимента, маркируйте извлеченный эмбрион флуоресцентными липофильными красителями, доставляемыми с помощью магнитных железных частиц, или полистирольными микросферами. Затем отслеживайте метки в процессе культивирования с использованием флуоресцентной микроскопии или оптической когерентной томографии.

Визуализация полученных карт морфогенетического напряжения позволяет определить области удлинения, сокращения и сдвига ткани как в двухмерном, так и в трехмерном пространстве. Здравствуйте, меня зовут Бен Филис, я аспирант в лаборатории доктора Ларри Тейбора на кафедре биомедицинской инженерии Университета Вашингтона в Сент-Луисе. Перед началом подобных экспериментов важно продумать подходящие методы культивирования тканей для вашей модельной системы, доступные методы визуализации, а также тип данных, которые вы планируете получить в результате экспериментов.

Например, интересует ли вас анализ деформаций ткани в двух или трех измерениях? Сегодня мы ответим на некоторые из этих вопросов, продемонстрировав два взаимодополняющих метода маркировки на раннем эмбрионе курицы. Здравствуйте, меня зовут Виктор Варнер, я работаю в лаборатории доктора Ларри Табора в Университете Вашингтона в Сент-Луисе.

В обоих этих методах мы быстро и одновременно маркируем сотни клеток в раннем эмбрионе цыпленка. Отслеживание перемещения этих меток позволяет нам не только определить ткани, в которых эти клетки в конечном итоге размещаются, но и количественно оценить деформацию на уровне тканей, которая формирует ранний эмбрион. Сначала инкубируйте яйца в продольном положении до достижения нужной стадии развития согласно классификации Hamburger and Hamilton.

Разбейте нижнюю часть яйца о край чашки Петри диаметром 150 миллиметров. Аккуратно разделите скорлупу в нижней части, вылейте содержимое яйца в чашку и с помощью тупых пинцетов удалите более густой вязкий альбумин с желтка. Затем проделайте отверстия в центре круглого фильтровального кружка.

Поместите одно из колец из фильтровальной бумаги на желток так, чтобы эмбрион был виден через центральное отверстие кольца. Обрежьте бумагу по внешнему периметру кольца микроножницами. Затем с помощью тонкого пинцета извлеките бумагу с прикрепленным эмбрионом из желтка и осторожно погрузите эмбрион в ванну с PBS. Чтобы удалить прилипшие частицы желтка, перенесите конструкцию из фильтровальной бумаги в культуральную чашку диаметром 35 миллиметров.

Поместив эмбрион в renting-кольцо из фильтровальной бумаги вентральной стороной вверх, зафиксируйте его с помощью металлического кольца и погрузите в культуральную среду. Если эмбрион не будет полностью погружен, геометрия тканей и последующий морфогенез могут быть значительно изменены из-за аномально высокого поверхностного натяжения.

Во время культивирования с помощью микроскопа в светлом поле проверьте правильность морфологии и стадию эмбрионального развития. Сначала возьмите небольшое количество железного порошка, добавьте несколько капель насыщенного красителя и спирта, затем высушите на воздухе с помощью кончика вытянутой микропипетки. Разбейте скопления частиц железа и перенесите их в микроцентрифужную пробирку.

После нескольких промывок деионизированной водой поместите собранный эмбрион спинной стороной вверх в чашку Петри диаметром 35 мм, заполнив ее достаточным количеством культуральной среды. Под диссекционным микроскопом с помощью стеклянной иглы удалите вителлиновую мембрану, чтобы открыть доступ к электродермальным клеткам. Затем наберите в пипетку-дозатор столбик меченных частиц железа.

Используя диссекционный микроскоп, погрузите пипетку так, чтобы её конец находился непосредственно над эмбрионом. Медленно перекатывайте пипетку между кончиками пальцев, чтобы равномерно распределить частицы по поверхности эмбриона. После 10-минутной инкубации при 37 °C удалите частицы с помощью сильного магнита.

При необходимости прикрепите магнит к магнитной паре тонких пинцетов и с помощью намагниченных пинцетов осторожно удалите все остаточные частицы железа. Перейдите к получению изображений эмбриона в светлом поле и в режиме флуоресценции. С помощью иглы 22 G.

Наберите раствор черных микросфер диаметром 10 мкм в PBS в шприц объемом 10 куб. см. Затем зашлифуйте кончики вытянутых стеклянных игл с помощью жесткого диска компьютера и заполните их раствором микросфер. Слегка постучите по микропипетке, чтобы раствор достиг кончика, используя микроманипулятор.

Поместите стеклянную иглу в то же поле зрения, что и эмбрион. Убедитесь, что микросферы выходят из кончика пипетки. Теперь введите кончик пипетки в просвет мозговой трубки.

Следите за тем, чтобы не проколоть вентральную стенку ткани. Контролируйте кратковременное набухание ткани по мере введения микросфер и жидкости в просвет. Затем быстро извлеките стеклянную иглу.

Наконец, убедитесь, что плотность микросфер во внутреннем просвете мозговой трубки достаточна. Используя микроскоп в светлом поле, дайте микросферам осесть в течение 20–30 минут перед получением изображений в светлом поле или набора данных оптической когерентной томографии. После получения первых изображений поместите до 7 культуральных чашек с образцами диаметром 35 миллиметров в чашку Петри диаметром 150 миллиметров и поместите всю конструкцию в небольшой пластиковый пакет.

Добавьте несколько капель деионизированной воды в пакет для увлажнения, затем заполните его смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа. Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 37 °C до следующего момента визуализации; перенесите маркированные эмбрионы в чашку delta T, содержащую 1,2 мл культуральной среды, и накройте чашку стеклянной крышкой, поддерживая температуру 37 °C. Обеспечьте перфузию эмбриона газовой смесью 95% O2 и 5% CO2, подаваемой с помощью мини-насоса с регулируемым расходом. Настройте программное обеспечение для автоматического получения изображений через заданные интервалы времени.

В ходе эксперимента метки можно отслеживать автоматически или вручную, а также рассчитывать карты морфогенетической деформации по координатам маркеров. В данной работе метод использования частиц железа применялся для маркировки и отслеживания перемещения клеток электродермы в процессе формирования головной складки. В раннем эмбрионе цыпленка флуоресцентно меченые клетки были распределены по всему эмбриону.

Изображения эмбриона, полученные с помощью светлого поля и флуоресценции, регистрировали через определенные интервалы времени в ходе культуры ex ovo. Это позволяло отслеживать перемещение меток тракта. Накопленные данные позволяют рассчитать распределение развивающейся морфогенетической деформации в процессе формирования головной складки.

Аналогичным образом метод использования полистирольных микросфер применялся для отслеживания перемещений тканей на границе среднего и заднего мозга на ранних стадиях развития мозга цыпленка. Следует отметить, что данный метод позволяет регистрировать выраженную трехмерную деформацию, так как микросферы имеют тенденцию прилипать ко всем стенкам внутреннего просвета мозга. После отслеживания перемещений микросфер в течение шести часов координаты маркеров позволяют рассчитать деформации, характеризующие изменение формы ткани в продольном и окружном направлениях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о некоторых экспериментальных этапах, необходимых для проведения собственного культивирования и маркировки тканей. Методы протокола, представленные здесь, особенно эффективны тем, что они минимально травмируют нативные ткани, а также основаны на использовании недорогих и общедоступных материалов. Эти эксперименты особенно полезны для изучения механики эмбрионального развития.

Поскольку поля деформации, рассчитанные на основе отслеживания движения меченых клеток, могут быть использованы как для проверки, так и для построения физических моделей морфогенеза.