Allelotyping ПЦР для выявления Salmonella enterica Сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium

Общей целью данного эксперимента является идентификация специфических аллелей антигена сальмонеллы. Это достигается путем нацеливания на ПЦР для выявления специфических различий в последовательностях, связанных с этими аллелями. Матрица образца добавляется в реакционную смесь ПЦР, содержащую аллель-специфичные праймеры и типирование по двум аллелям OH и H.

ПЦР проводится в термоамплификаторе. Затем образцы ПЦР разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза, чтобы определить размер ампликона, если он присутствует в каждом образце, или изолировать его. Затем размер ампликона коррелируют с ожидаемым размером для каждого из наборов праймеров, используемых в ПЦР, получены результаты, которые показывают идентификацию специфического антигена сальмонеллы.

Аллели по обозначению ПЦР SEROVAR затем получают на основе результатов мультиплексных ПЦР-анализов OH one и H two. Основное преимущество протокола, описанного в этом видео, перед SYP заключается в том, что он быстрый, простой в интерпретации и менее затратный. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы в области эпидемиологии, такие как определение распределения и персистенции сальмонелл VAR внутри или между птицеводческими или молочными фермами.

Применение этого метода распространяется на быструю диагностику лососевого оза, приписываемого сальмонелле, сероварам, ариусу или уриану. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для понимания того, как использовать этот метод на основе ПЦР для определения типа сальмонеллы до уровня серовара. Демонстрировать эту процедуру будут Адриана Педросо и Инь Чанг, научные сотрудники из лабораторий Ли Мауэра в Университете Джорджии, чтобы подготовить шаблон ДНК целой клетки для последующей ПЦР-реакции.

Сначала привите сальмонеллой один миллилитр бульона LB. Изолировать от одной колонии. Инкубируют культуру с встряхиванием со скоростью от 200 до 250 оборотов в минуту и температурой инкубации 37 градусов по Цельсию.

На следующий день перенесите одну миллилитровую культуру в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте суспензию в течение примерно двух минут при 4500-кратном давлении силы тяжести, чтобы гранулировать клетки, затем аспирируйте супнатант, а затем повторно суспендируйте бактериальную гранулу в одном миллилитре 100% этанола, инкубируйте взвешенные клетки этанола при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем центрифугируйте в клетках, как раньше. Ресуспендируйте гранулу в одном миллилитре PBS После центрифугирования аспирируйте супинат и суспендируйте гранулу в одном миллилитре стерильной дистиллированной воды. Окончательно разведите клеточную суспензию.

Один из 20 с дистиллированной водой и хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до одного месяца до готовности к выполнению ПЦР-приготовление и дозирование реакционной смеси ПЦР необходимо проводить в физически отдельном помещении и предпочтительно на специальной рабочей станции ПЦР, оснащенной ультрафиолетовым светом. Сначала обеззаритите рабочую поверхность ультрафиолетовым излучением и протереть 10% отбеливателем. Затем используйте пипетку, предназначенную исключительно для ПЦР и оснащенную барьерным наконечником для пипетки.

Сделайте мастер-грунтовочный запас, сначала разбавив грунтовки в пяти раз по 10 до минус четырех моляров дистиллированной водой. Затем разбавьте бульон один к 20 дистиллированной водой до достижения рабочей концентрации 25 микромоляров. Достаньте реагенты для ПЦР и целую клеточную матрицу из морозильной камеры и разморозьте на льду.

Оставьте ДНК-полимеразу в морозильной камере до тех пор, пока она не понадобится. Соедините реагенты ПЦР в соответствии с таблицей первой письменного протокола. Далее пипеткой пипеткой наберется девять микролитров ПЦР-реакции.

Смешайте в лунки стерильного 96 круглого дна лунки с микротитровкой из полистирола. Начните с верхней части первой колонки и двигайтесь вниз по колонке, а затем к верху следующей колонки, добавьте один микролитр дистиллированной воды в первую лунку, чтобы она служила отрицательным контролем. Затем дозируйте 0,5 микролитра положительных контрольных матриц в смесь для ПЦР во вторую лунку и по одному микролитру кишечной палочки К 12 DH пяти альфа в третью.

Ну, добавьте один микролитр третьего образца матрицы к остальным лункам для H, один I и gyp PCR Salmonella entera, CVaR, TYM и Enteritis послужат положительным контролем для глазных и GM аллелей соответственно. Сальмонеллы CVaR, heidelberg и haar являются положительными контрольными группами, которые будут использоваться во второй ПЦР с типированием одного аллеля H для обнаружения аллелей r и z 10 соответственно. Затем поместите стеклянные капилляры емкостью 10 микролитров в специальные держатели для технологии Айдахо.

Rapid Cycler после закрепления в держателе загрузите каждый стеклянный капилляр смесью для реакции ПЦР, прикоснувшись к капиллярам на дне лунок. Наклоните держатель, чтобы жидкость могла перемещаться вниз по пробирке и обеспечить пространство между концами и смесью для ПЦР. Перед термосваркой стеклянных трубок с помощью бутановой горелки для герметизации обоих концов капилляров поместите капиллярные трубки и держатель в быстрый амплификатор по технологии Айдахо и используйте программы термоамплификаторов, описанные в таблице 1 письменного протокола для различных типов ELO в ПЦР.

После того, как программа термоамплификатора будет завершена, перейдите к этапу электрофереза геля размером 15 на 10 см. В соответствии со стандартными процедурами возник гель класса молекулярной биологии, содержащий бромид натрия. После того, как гель застынет, перенесите гель в погружную горизонтальную камеру электрофореза, содержащую один буфер для электрофореза TAE, предварительно смешанный 200 микролитров 0,25 мг на миллилитр.

Молекулярно-массовые маркеры ДНК с 40 мкл шестикратной загрузки ДНК с нагрузкой красителя, 4,8 мкл предварительно смешанного молекулярного маркера ДНК на первую, среднюю и последнюю лунки. Далее извлеките из держателя стеклянный капилляр, содержащий реакцию образца ПЦР, и протравите оба конца капилляра стеклорезом. Затем поместите большой и указательный пальцы обеих рук по обе стороны от капилляра, отмеченного стеклорезом, и защелкните капилляр, поместите капиллярный дозатор на конец, противоположный смеси для реакции ПЦР, и медленно поворачивайте поршень по часовой стрелке, пока жидкость не окажется на самом дне пробирки.

Поместите капилляр в лунку, которую нужно загрузить, и медленно поверните поршень по часовой стрелке, чтобы выдать взвешенный образец в возникший образец. Будьте осторожны, чтобы не проколоть лунку капилляром и не ввести пузырь воздуха в лунку, продолжая поворачивать поршень после того, как последняя жидкость покинет капилляр. После того, как все образцы и стандарты будут загружены, установите постоянное напряжение источника питания на 90 вольт.

По завершении электрофореза перенесите гель в УФ-трансосветитель для визуализации фрагментов ДНК и стандартов молекулярной массы, получения изображений на гелевой док-системе XR. Наконец, поместите капилляродержатели в 10% отбеливатель на 15-30 минут. Трижды промойте дистиллированной водой и снова поместите в помещение для установки ПЦР для сушки на воздухе.

Этот первый гель для окрашивания бромида атерия показывает результаты мультиплексной ПЦР на О-аллель, ассоциированный с сальмонеллой entera var, энтеритом, хаддой Гейдельберг. Полосы 1 и 13 содержат пару оснований 100. Лестница ДНК.

Вторая дорожка содержит мультиплексный ПЦР-контроль для аллелей O B, C 1, C 2, D 1 и E. Остальные линии с третьей по 12 содержат изоляты сальмонеллы. Обозначение аллеля изоляту сальмонеллы присваивается на основании ампликона, соответствующего размеру ПЦР-контроля и прогнозируемого для наборов аллелей prima, используемых слева направо. Эти размеры ампликонов следующие: D 1 620 пар оснований, C две 400 пары оснований, E 1 280 пар оснований, C 1 340 пар оснований и B 560 пар оснований.

Этот гель для окрашивания бромидом иридия показывает результаты мультиплексной ПЦР с H-1 аллелем для идентификации геля FLA в аллелях глаза и гм. Гель загружался в том же порядке, что и показано ранее. Опять же, каждому изоляту присваивается аллель H one в зависимости от наличия ампликона, совпадающего по размеру с контролем ПЦР, и как и прогнозируется для четырех наборов праймеров H one allel, используемых слева направо.

Размеры ампликонов - это пары оснований GM 310 и пары оснований I 510. Этот гель для окрашивания бромида спинномозгового атерия показывает результаты мультиплексной ПЦР по аллелю H one для идентификации аллелей геллина r и z 10. Опять же, гель загружали таким же образом, как показано ранее, и каждому изоляту присваивают аллель H one в зависимости от наличия ампликона, соответствующего по размеру контролю ПЦР, и, как и прогнозировано для четырех использованных наборов праймеров H one allel, размеры ампликонов составляют R 170 пар оснований и Z десять триста шестьдесят пар оснований после освоения.

Эту технику можно выполнить за четыре часа при правильном выполнении. Пытаясь выполнить эту процедуру, не забывайте физически отделять ПЦР-настройку и гель-электрофорез друг от друга, чтобы свести к минимуму вероятность переноса ПЦР-контаминации.