Дрозофилы куколки Живот Immunohistochemistry

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке эпителия брюшной полости дрозофилы к иммуногистохимии. Это достигается сначала двусторонним путем рассечения стадии drosophila puy и удаления внутренних органов таким образом, что только брюшной эпителий состоит из пролиферирующего имагинального эпителия. Его остеобласт и эпидермальные клетки личинок остаются прикрепленными к мембране зрачка.

Затем ткань фиксируют, инкубируют с антителами, удаленными из наружного зрачка, и визуализируют с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии, чтобы показать общую морфологию эпителия брюшной полости и экспрессию белков, представляющих интерес. Привет, я Джон Йодер. Моя лаборатория находится в Университете Алабамы на факультете биологических наук.

Привет, мы победили. Я учусь в лаборатории Йоды. Сегодня мы покажем вам наш метод препарирования дрозофилы, чашечки и иммуногистохимии брюшка куколки дрозофилы.

Этот метод может быть использован для исследования процессов морфогенеза эпителия и перестройки тканей. В частности, мы используем этот метод для исследования развития полового диморфизма брюшка взрослой дрозофилы из флакона с температурой 25 градусов Цельсия без идентификации взрослых. Недавно обездвиженные пюи-пюи с кутикулой, которая еще не начала загорать, считаются нулевыми часами ПФ. С помощью смоченной кисти аккуратно удалите эти пуи и поместите их на крышку увлажненной камеры С помощью кисти и PBS аккуратно смойте мусор из корпусов пуэров, если это необходимо.

Сортируйте пюи по половому признаку в ноль часов. Первобытные отростки самцов ПФ хорошо видны через кутикулу зрачка. Примерно на двух третях пути вниз по телу самки примордиальных пород меньше и их не так легко идентифицировать.

Теперь поместите пуб на смоченную фильтровальную бумагу во увлажненную камеру. Установите крышки на место и верните их в среду с постоянной температурой. Когда животные достигнут интересующей точки времени развития, приступайте к вскрытию.

Имейте в виду, что ПФ, обработанный от 24 до 32 часов, наиболее подвержен потере эпителиальных клеток во время последующей обработки. Подготовьтесь к вскрытию, обхватив куском двустороннего скотча с одной стороны прозрачного предметного стекла. Затем с помощью щипцов аккуратно захватите каждый зрачок между передними сферическими элементами и поместите их на ленту тыльной стороной вверх.

Выстройте таким образом максимум 10 СИЗ, иначе вы рискуете работать слишком медленно. Через пять-10 минут СИЗ будут полностью полюбиться, но прежде чем это произойдет, используйте кисть, чтобы равномерно распределить их и расположить параллельно. Длительная сушка на этом этапе ухудшит их качество.

Так что действуйте быстро. Теперь с помощью хирургического скальпеля рассеките каждый зрачок А с обеих сторон. Сделайте один быстрый надрез от переднего к заднему концу куколки.

Если все сделано правильно, разрез будет разделен пополам как передней, так и задней сферическими парами, образуя симметричные левую и правую половины, чтобы освободить пулю от ленты. С помощью кисти нанесите небольшое количество PBS на каждую рассеченную куколку с помощью хирургических щипцов. Возьмите одну половинку куколки за передний конец и погрузите ее в заполненную PBS чашку для ополаскивания на предметном столике для препарирующего микроскопа, все еще держа куколку, с помощью пипетки аккуратно смойте внутренние ткани, закачав PBS в брюшную полость.

Избегайте приложения слишком большого давления, иначе клетки будут потеряны из эпителия. Немедленно погрузите чистую ткань в 400 микролитров буфера для фиксации комнатной температуры, очистите все половинки куколки. Аналогично с практикой, препарирование и промывка половинок 20 ПУ должно занимать не более пяти минут.

Дайте пуям поинкубироваться в фиксирующем буфере при комнатной температуре в течение часа, а затем промойте их трижды в 400 микролитрах PBS в течение пяти минут за одну стирку. Чтобы хранить образцы, сначала дважды промойте их в 100% метаноле, а затем перенесите в 100% этанол для хранения. Эти образцы могут храниться в 100% этаноле при температуре минус 20 градусов Цельсия до трех месяцев без потери клеток или реакционной способности эпитопов.

Для обработки хранящихся образцов их необходимо предварительно переоценить в PBS с помощью серии этанола. Продолжайте иммуногистохимический анализ, блокируя образцы в PBS 2% BSA в течение часа при комнатной температуре и без раскачивания. Раскачивая образцы, значительно увеличивает потерю клеток из брюшного эпителия.

Затем замените блокирующий раствор первичным антителом, разведенным до соответствующей концентрации в PBS. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия без раскачивания и в закрытой увлажненной камере, чтобы предотвратить испарение на следующий день. Промойте образцы три раза в PBS без раскачивания и в течение 10 минут за промывку.

Затем заблокируйте образцы на час без раскачивания в PBS с 2% BSA. Замените блочный раствор вторичным антителом комнатной температуры в PBS. Затем инкубируйте образцы в темноте в течение трех часов и без раскачивания.

Вслед за вторичным антителом введите три васы в PBS в течение 10 минут каждый, если это необходимо. Противостоит пюи, например, ядрам можно окрашивать с помощью 10-минутной инкубации в DPI, разбавленном PBS. Затем выровняйте образцы в монтажных средах минимум на 30 минут.

Чтобы установить образцы, возьмитесь за корпус каждого зрачка спереди, избегая внутренней оболочки зрачка второй парой щипцов. Аккуратно возьмитесь за внутреннюю мембрану зрачка за головку. Затем аккуратно вытащите образец из корпуса зрачка.

Перенесите образец unca на предметное стекло с 75–100 микролитрами ротовой среды. На одном слайде может быть установлено несколько образцов. Теперь с помощью щупа и щипцов равномерно расположите образцы в углублении.

Хорошо поверните их так, чтобы их боковые поверхности были обращены вверх и удалите все пузырьки воздуха с помощью щупа. Наконец, аккуратно опустите крышку на образцы, не вводя пузырьков воздуха для этого препарата. Микроскопия структурированного освещения будет сравнима с конфокальными методами.

Это проекция 50 конфокальных изображений с расстоянием 2,5 мкм между срезами. Ткань находится в состоянии 26 часов ПФ, и окрашивание показывает паттерн экспрессии бескрылого белка и GFP, управляемого Граалем, и ядер. Передняя часть находится слева, а дорсальные — в верхней части экрана.

В этом фильме показано, как с помощью этой процедуры сохраняется общая морфология образцов. Таким образом, это позволяет трехмерно реконструировать стеки изображений. Освоенные Вестом несколько десятков зрачков могут быть сохранены и помещены в фиксирующий буфер менее чем за 30 минут.

Кроме того, образцы, полученные с использованием этого протокола, поддаются гибридизации, что делает его ценным протоколом для исследований экспрессии генов.