Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

Общая цель данного эксперимента заключается в количественной оценке пополнения и мобилизации специфических синаптических везикул в центральных нервных окончаниях с использованием методов живой флуоресцентной визуализации. Это достигается за счет мониторинга двух раундов рециркуляции синаптических везикул с использованием FM-красителей в одних и тех же нервных окончаниях для обеспечения действительного внутреннего контроля. В качестве второго шага легко высвобождаемый пул и резервный пул последовательно исчерпываются с использованием специальных протоколов разгрузки, которые позволяют количественно оценить относительные размеры пула.

Затем измените условия загрузки или разгрузки, чтобы изучить влияние выбранной вариации на синаптические везикулы, пополнение пула или мобилизацию. Результаты показывают, что FM d загрузка различных синаптических физических пулов воспроизводима на основе количественной оценки и анализа выгрузки вызванного красителя. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как семейство генетических репортеров Fluent, заключается в том, что эта методика отслеживает пополнение пулов именно синаптическими везикулами, подвергшимися эндоцитозу.

Это также позволяет проводить точную количественную оценку. Так как данный протокол выполняется дважды в одних и тех же нервных окончаниях, обеспечивая внутренний контроль. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синаптика, эндоцитоза и экзоцитоза, например, как манипуляции в конкретных режимах эндоцитоза могут повлиять на пополнение как общего пула рециркуляции, так и синаптических пулов CLE в нем, таких как легко используемый пул и резервный пул.

Базовая экспериментальная установка должна состоять из инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа, охлаждаемой ПЗС-камеры, флуоресцентного источника света, гравитационного перфузионного аппарата, камеры визуализации с параллельными платиновыми электродами и электрическим стимулятором и компьютера. Проводите эксперименты в темноте или в условиях красного света с минимальным флуоресцентным освещением образца, чтобы избежать обесцвечивания FM-красителем. Начните эту процедуру с использования семидневных детенышей крысы spra dolly для подготовки первичных культур гранулярных нейронов мозжечка.

После того, как культуры были подготовлены, наложите на нейроны в центр покрытого поли D лизином покрытием толщиной 25 миллиметров, проскользните каплей, не превышающей семи миллиметров в диаметре, через один час добавьте два миллилитра питательных сред к нейронам. Поместите одну защитную крышку в солевой раствор при комнатной температуре на 10 минут, чтобы обеспечить стабилизацию в новой среде. После этого снимите покровную крышку, высушите ее нижнюю сторону, а область вокруг прикрепленных клеток небольшим кусочком бумажного полотенца или впитывающей бумаги.

Затем с помощью силиконовой смазки приклейте защитное стекло к нижней части камеры визуализации. Ячейки должны находиться между двумя параллельными проводами. Используйте достаточное количество силиконовой смазки, чтобы полностью герметизировать камеру, не вторгаясь в центр банной камеры.

Далее аккуратно заполните камеру ванны примерно 260 микролитрами солевого раствора. Затем заполните входную и выходную трубки тем же раствором. Загерметизируйте камеру, приклеив сверху чистый защитный лист с силиконовой смазкой.

После этого удалите все пузырьки воздуха, попавшие в камеру с помощью входной и выходной трубок. Затем обездвижите камеру визуализации в платформу из нержавеющей стали. Проверьте наличие утечек, осторожно пролив солевой раствор через входную трубку.

Следующим этапом является монтаж собранной камеры на предметный столик инвертированного микроскопа. Загрунтовать входное отверстие системы гравитационной перфузии солевым раствором и подсоединить камеру к входу. Затем присоедините соединительные провода камеры к электростимулятору.

Перфузируйте нейроны 1,5 миллилитрами разведенного fm красителя. Затем стимулируйте нейроны с помощью прилагаемого стимулятора, чтобы вызвать поглощение красителя После стимуляции перфузируйте нейроны свежим физиологическим раствором в течение двух минут, чтобы смыть излишки FM-красителя. Затем подержите нейроны в солевом растворе в течение восьми минут.

Тем временем найдите аксональные сети, в которых видны отдельные нервные окончания, нагруженные FM D. Использование длин волн флуоресцеина. Избегайте участков с скоплениями клеток.

Затем выполните повторную фокусировку изображения непосредственно перед получением изображения, так как во время отдыха может произойти небольшой дрейф. Начинайте съемку изображений с интервальной съемкой со скоростью один кадр каждые четыре секунды. После получения от 5 до 10 исходных изображений вызывают экзоцитоз легко высвобождаемого пула путем стимуляции с частотой 30 Гц в течение двух секунд.

После получения еще 10 изображений вызвать синаптические везикулы, экзоцитоз резервного пула с помощью трех стимуляций по 40 герц в течение 10 секунд с интервалом 40 секунд между стимуляциями, получить еще от пяти до 10 изображений. Затем приостановите получение изображения. Дайте нейронам восстановиться в течение не менее 20 минут и повторите этот протокол S one phase снова в S two phase для контрольного эксперимента.

Для анализа данных преобразуйте изображения в стек. Используя встроенную функцию image J, затем отрегулируйте яркость и контрастность стека, чтобы максимизировать динамический диапазон, если произошел значительный горизонтальный дрейф. Во время эксперимента запустите плагины stack reg и turbo reg на изображении J, чтобы выровнять стек изображений.

Затем плагин анализатора временных рядов. Затем определите области интереса по крайней мере на 90 нервных окончаниях. Полезно переключаться между изображениями до и после разгрузки кристалла, чтобы выявить активные нервные окончания.

Идеальный размер области интереса — это тот, который немного больше типичного нервного окончания. Затем получите общую интенсивность флуоресценции каждой интересующей области с течением времени. После этого экспортируйте в Microsoft Excel.

Здесь показана блок-схема контрольного эксперимента, в котором гранулярные нейроны мозжечка были загружены 10 микромолярами FM 1 43 с использованием стимуляции 80 герц в течение 10 секунд. Вот изображение, показывающее нервные окончания, загруженные FM 1 43. Вот то же изображение, показывающее 90 пронумерованных областей интереса, выбранных для анализа после идентификации активных нервных окончаний, и это изображения нервных окончаний в выбранные моменты времени.

Эти изображения представлены в псевдоцвете, чтобы проиллюстрировать изменения флуоресценции по мере истощения различных бассейнов синаптических везикул. Наконец, здесь показаны нормализованные флуоресцентные единицы этих 90 нервных окончаний. В фазах S-1 и S-2 можно измерить падение флуоресценции при каждой последовательной стимуляции и сравнить между фазами S-1 и S-2.

В этом контрольном эксперименте как S-1, так и S-2 привели к одинаковым размерам легко высвобождаемого и резервного пулов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как количественно оценить пополнение и мобилизацию специфических синаптических везикул в центральных нервных окончаниях с помощью методов флуоресцентной визуализации жизни. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о подтверждении жизнеспособности и чувствительности клеток путем проведения контрольных экспериментов с S-1, прежде чем изменять условия эксперимента S-2.