Количественный анализ на инсулиноподобный выражения колониеобразующих прародителей

В этом видео демонстрируется процедура создания трехмерных культур, которые позволяют предшественникам, подобным клеткам поджелудочной железы, дифференцироваться в инсулин-экспрессирующие колонии. Сначала дифференцированные клетки, полученные из линии эмбриональных стволовых клеток мыши neurogen in three EGFP Knockin, подвергаются диссоциации и сортировке по экспрессии EGFP для обогащения популяции эндокринными предшественниками. Отсортированные одиночные EGFP-положительные клетки высевают в полутвердую среду, содержащую Matrigel и факторы роста.

Это ограничивает перемещение отдельных клеток-предшественников, обеспечивая при этом их выживание, пролиферацию и дифференцировку in vitro. Затем под микроскопом подсчитывают и оценивают количество образовавшихся колоний с характерной морфологией для расчета частоты колониеобразующих предшественников в данной отсортированной популяции. Анализ отдельных колоний с помощью ПЦР в реальном времени и иммунофлуоресцентной микроскопии выявляет экспрессию инсулина в колониях, полученных из ngn three положительных клеток, но не в колониях из NGN three отрицательных клеток.

Основным преимуществом использования данной методики по сравнению с существующими методами, такими как культивирование панкреатических сфер в суспензии, является то, что она позволяет одновременно исследовать большее количество клеток на предмет их внутренней способности к формированию колоний прогениторов. Этот метод может помочь в решении вопросов, касающихся биологии стволовых клеток и клеток-предшественников поджелудочной железы, например, того, какие маркеры экспрессируют прогениторные клетки и какие внутренние или внешние факторы важны для поддержания самообновления и дифференцировки этих клеток. Значение данной методики может распространяться на терапию диабета 1-го типа, поскольку если будет возможно идентифицировать панкреатические прогениторные клетки и дифференцировать их в бета-подобные клетки, то такие клетки можно будет использовать для замены поврежденных бета-клеток у пациентов с терминальной стадией диабета 1-го типа.

Этот метод также может быть применен к другим системам, например, при изучении колониеобразующих клеток-предшественников постнатальной и взрослой поджелудочной железы, костного мозга, печени и селезенки. Как правило, новичкам в этой технике бывает сложно, так как диссоциация клеток в суспензию одиночных клеток, а также работа с матригелем и метильцеллюлозой при подготовке к дозированию могут вызвать затруднения. Идея этого метода возникла у меня, когда я осознал отсутствие клоногенного анализа для изучения линейной взаимосвязи между клетками-предшественниками и их дифференцированным потомством в поджелудочной железе.

Подобный анализ колониеобразования в прошлом играл важную роль в изучении гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток. Я осознаю необходимость в таком анализе для изучения биологии стволовых клеток поджелудочной железы. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как полутвердый компонент среды по своей природе является вязким, а этапы приготовления и дозирования трудно освоить.

Процедуры продемонстрируют Майкл Винклер, магистрант, Нэнси, лаборант, и доктор Ланг Цзин, постдокторант, для получения кондиционированной среды, которая будет использована в дальнейшем для анализа колониеобразующей способности. Эс-клетки нейронов дифференцируют в клетки, подобные клеткам поджелудочной железы, in vitro. Начните выполнение данной процедуры с изучения эмбриональных телец шестидневного возраста под световым микроскопом.

По крайней мере 30–40% из них должны иметь диаметр не менее 150 микрон. В более крупных телах эмбрионов должны присутствовать темные пятна, свидетельствующие о более выраженной дифференцировке. Перенесите от 80 до 100 тел эмбрионов в каждую лунку шестилуночной адгезионной планшета, затем осторожно покачайте планшет, чтобы собрать тела эмбрионов в центрах лунок для усиления межклеточных контактов.

Такие контакты способствуют более эффективному развитию панкреатоподобных клеток из эмбриональных тел. Осторожно поместите планшеты обратно в инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide в среде для культивирования. A 13.

Замените среду на свежую среду для адгезивного культивирования, содержащую никотинамид и рекомбинантный активный белок человека Activin beta B для индукции дифференцировки эндокринных клеток. Затем верните культуры в инкубатор. На 16-й день сбора соберите среду и профильтруйте ее через полиэфирсльфоновую мембрану с порами 0,2 мкм для удаления клеточного детрита.

С этого момента собранная среда будет называться кондиционированной средой. Разлейте кондиционированную среду по коническим полипропиленовым пробиркам объемом 15 мл и храните их при температуре -80 °C до непосредственного использования. Neurogenin 3 представляет собой транскрипционный фактор, экспрессируемый эндокринными предшественниками поджелудочной железы в процессе развития. Эндокринные предшественники, экспрессирующие Neurogenin 3, в конечном итоге дифференцируются в клетки, экспрессирующие глюкагон (альфа-клетки), инсулин (бета-клетки), соматостатин (дельта-клетки), грелин (эпсилон-клетки) и панкреатический полипептид. Для облегчения идентификации клеток, экспрессирующих Ngn3, один аллель локуса Ngn3 в линии мышиных эмбриональных стволовых клеток с нокаутом был заменен репортерным геном EGFP. Полученная клеточная линия была обозначена как NGN3-EGFP. Чтобы получить дифференцированные NGN3-EGFP-положительные и NGN3-EGFP-отрицательные клетки.

Сначала, на 16-й день, клетки отделяют от культуральных планшетов с помощью трипсина для получения суспензии одиночных клеток. Клеточные агрегаты инкубируют с коллагеназой B и ДНКазой, после чего пропускают через сетку с размером пор 40 или 70 микрон. Затем добавляют DPI, и клетки разделяют на клеточном сортере путем анализа прямого и бокового светорассеяния, которые 각각 указывают на размер и гранулярность клеток соответственно, и строят соответствующие графики.

Затем устанавливается гейт для исключения неклеточного детрита. Для идентификации мертвых клеток, которые будут окрашены положительно, используется DPI. При возбуждении в диапазоне 405–413 нм и регистрации эмиссии с помощью фильтра 454/40, гейтирование по ширине импульса (ширине электронного импульса прямого светорассеяния) позволяет выявить дуплеты, которые должны быть удалены перед прохождением через сортер клеток, активируемый флуоресценцией, с гейтированием по каналу EGFP FL1 относительно автофлуоресценции.

Использование клеток 16-го дня из контрольной родительской клеточной линии, такой как TL, показанной на левой панели, позволяет выявить истинную флуоресценцию, благодаря чему популяцию NGN three EEG FP положительных клеток можно визуализировать, как показано на правой панели. Граница сортировки (gate) для NGN three EGFP положительных клеток намеренно смещена вправо, как указано здесь стрелкой, чтобы ограничить контаминацию NGN three EEG FP отрицательными клетками в процессе сортировки. После установления границ NGN three EEG, FP положительные и NGN three EGFP отрицательные клетки сортируют и хранят на льду до использования при подготовке к посеву.

Накануне эксперимента поместите Matrigel на лед при температуре 4 °C. В день проведения эксперимента следующие реагенты или растворы должны находиться на льду: DMEM/F12, метилцеллюлоза, кондиционированная среда, FCS, никотинамид, XTEND-4, VEGF A и рекомбинантный активный human Activin B. Минимум за полчаса до использования поместите стерильный набор наконечников для 200 µL пипетки при температуре -20 °C. В preparation к высеву отсортированных клеток необходимо сначала добавить компоненты полутвердой среды в полистирольную пробирку объемом 5 mL. Сначала с помощью иглы калибра 16,5 наберите в шприц небольшое количество 3,3% раствора метилцеллюлозы.

Затем немедленно вытолкните раствор, чтобы удалить воздух. Это заполнит мертвое пространство в шприце раствором и обеспечит правильное измерение объема полутвердого раствора. После этого, избегая образования пузырьков воздуха, наберите и перенесите необходимый объем раствора метилцеллюлозы в пробирку объемом 5 мл.

Добавьте кондиционированную среду, содержащую FCS, никотинамид, четыре активных фактора в бета B, VEGF A и D-M-E-M-F 12. Затем с помощью охлажденных наконечников для дозатора добавьте матригель. В завершение внесите необходимое количество отсортированных клеток в пробирку объемом 5 мл.

Клетки следует добавлять в самую последнюю очередь, чтобы избежать их преждевременной стимуляции. Затем плотно закройте пробирку крышкой и энергично и тщательно встряхните ее вручную. Поскольку при встряхивании образуются пузырьки воздуха, поместите пробирки на лед на пять минут или до тех пор, пока мелкие пузырьки воздуха не поднимутся на поверхность.

Используя шприц объемом 1 мл с иглой калибра 18,5, наберите небольшое количество смеси клеток в полутвердой среде и немедленно удалите воздух из шприца. Затем медленно внесите по 500 µL полутвердой смеси клеток непосредственно в центр каждой лунки 24-луночного планшета с низкой адгезией. Каждый образец следует высевать в четырехкратной повторности; для культивирования используются только четыре центральных столбца горизонтально ориентированного 24-луночного планшета.

Заполните оставшиеся лунки стерильной водой для поддержания увлажнения культуры в лунке. Сразу после посева осмотрите клетки под световым микроскопом.

Одиночные клетки случайным образом и равномерно распределяются по лункам. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 8–12 дней. После инкубации в течение 8–12 дней снова осмотрите клетки под микроскопом.

Это хороший пример равномерно распределенного матригеля в культуре. Здесь представлен пример неравномерно распределенного матригеля, приводящего к образованию островковых структур. Колонии не растут там, где матригель отсутствует.

Это пример фона лунки, в которой в смесь полутвердой среды не добавляли Matrigel. Чтобы подсчитать образовавшиеся колонии, прикрепите сетку под планшетом. Затем с помощью объектива с 10-кратным увеличением наблюдайте и подсчитывайте колонии; из-за трехмерной структуры среды колонии будут находиться в разных фокальных плоскостях.

Таким образом, при наблюдении с помощью световой микроскопии может потребоваться регулировка фокуса для каждой колонии. Здесь представлены репрезентативные микрофотографии экспрессирующих инсулин колоний в полутвердой культуре через 8–12 дней; колонии, отмеченные стрелками, распределены случайным образом и выглядят как небольшие темные не отражающие свет скопления диаметром примерно 60–100 микрон. Последующий микрофлюидный анализ RT-PCR отдельных колоний, отобранных вручную, выявил экспрессию инсулина 2 и глюкагона, что согласуется с нашим предыдущим отчетом. Эти результаты демонстрируют способность отдельных NGN3-EGFP-положительных клеток дифференцироваться в колонии, одновременно содержащие два гормона островков, что напоминает примитивные эндокринные клетки первой волны; экспрессия белка eptide, маркера продукции инсулина de novo, была подтверждена с помощью флуоресцентного окрашивания целого препарата.

Резюмируя, при проведении анализа колониеобразующих единиц, экспрессирующих инсулин, в соответствии с описанным в данном отчете методом, можно легко определить количество отдельных прогениторов, способных образовывать колонии. Как показано здесь и в нашем предыдущем отчете, колониеобразующие единицы, экспрессирующие инсулин, могут быть обогащены путем сортировки NGN EGFP-положительных, но ngn three EEG FP-отрицательных клеток, полученных из ЭСК крысы in vitro. После освоения данная техника занимает от одного до трех часов после сортировки. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости полной диссоциации клеток в суспензию из отдельных клеток и хранении всех компонентов среды на льду во избежание затвердевания матригеля, а также о том, что клетки следует добавлять в пробирки в последнюю очередь, чтобы избежать их преждевременной стимуляции. После выполнения этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как манипуляции с отдельными клетками, для получения ответов на дополнительные вопросы, например, достаточно ли одной клетки для инициирования формирования колонии после ее развития.

Данная методика откроет новые возможности для исследователей в области биологии стволовых и прогениторных клеток поджелудочной железы. Она позволяет изучить потенциал самообновления и способность к дифференцировке в бета-подобные клетки. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить количественный анализ колоний для инсулин-экспрессирующих колониеобразующих прогениторов.