CD4 + T-лимфоцитов Захват Использование одноразовых микрофлюидный чип на ВИЧ

Здравствуйте, меня зовут Ричард Лин, и я являюсь исследователем в группе профессора Т.И. Мерси в Гарвардском отделении медицинских наук и технологий Массачусетского технологического института. Проект, над которым я работаю, заключается в количественном определении и захвате CD четырех положительных и C3-положительных Т-лимфоцитов. Кровь пациента должна использоваться в условиях ограниченных ресурсов.

Итак, прямо передо мной у нас есть устройство для микрозаполнения, состоящее из PDMS, который является полиметилслоуном. Прибор, сам канал, максимум высотой 50 микрометров и общий объем в приборе 10 микролитров. Это чрезвычайно точное устройство, которое мы собираемся использовать для захвата Т-хелперных лимфоцитов.

По сути, это диагностический ориентир для пациентов с ВИЧ. Таким образом, поверхность микрофлюидного устройства уже подготовлена с белком и CD-четырьмя положительными антителами в шприце. Сейчас у нас есть только биологический буфер PBS с pH 7,4, и теперь мы будем подавать его в канал, чтобы вымыть лишнее положительное антитело CD 4.

На этом этапе скорость не нужно контролировать, потому что мы просто пытаемся избавиться от лишнего, и на самом деле не имеет значения, какова наша скорость. Вот здесь, вот где будут входные отверстия устройства, а это будут выходы наши, слева от меня и справа от вас. Итак, теперь я выпущу лишний раствор антитела, и если вы заметите на выходе, что жидкость выходит, вы знаете, что это очень малое количество, но если вы присмотритесь, вы увидите, что жидкость выходит из канала через трубку.

Итак, теперь, когда мы вымыли лишний раствор антител, мы можем подготовиться к введению крови. Теперь я отключу трубку от входного отверстия. Так что теперь мы откроем новый шприц для крови, человеческой крови, цельной крови.

Так что это не образец пациента, это здоровый образец, здоровый образец субъекта, пока мы готовимся к введению крови в микрофлюидное устройство. Итак, мы прикрепим шприц к шприцевому насосу. Теперь мы включим, и вы увидите скорость потока шприца, и мы установили ее на пять микролитров в минуту.

И теперь мы в основном подготовимся к инъекциям в кровь. Мы разместим насос шприца вертикально, потому что, как мы знаем, клетки крови откладываются, и мы хотим, чтобы клетки стекали в канал. Поэтому лучше отложить ячейки на дно, которое находится прямо рядом с нашей трубкой.

Итак, теперь все настроено и готово к работе. Объем моего прибора составляет 10 микролитров на 10 микролитров. И объем, который мы хотим влить в стенку канала, тоже 10 микролитров.

Так что я могу сказать, достаточно ли у меня крови, просто взглянув на цвет канала, если он весь красный, весь заполнен, тогда знайте, что я вливаю 10 микролитров, и мне следует остановить бампер шприца. Итак, теперь я нажимаю кнопку запуска, и иногда это начинается, иногда требуется некоторое время, прежде чем кровь действительно попадет в канал. И это во многом связано с давлением.

Например, когда мы ставим туда шприц, иногда мы извлекаем или вводим жидкость соответствующим образом, чтобы отрегулировать кровь в трубке. Так что это может занять некоторое время, но как только он начинает закачивать в канал, скорость потока устанавливается на уровне ly в минуту, что нам и нужно. Так что мы можем быть немного терпеливыми и ждать, иногда приходится ждать две-три минуты, прежде чем кровь начнет приходить в канал.

На самом деле, вы можете видеть, что кровь начинает течь в канале. Так что можно сказать, что прямо сейчас устройство практически полностью заправлено. Итак, теперь мы переключим трубку обратно на PBS, чтобы промыть кровь, которая находится в канале.

И для этого мы повторим то, что мы уже делали для удаления трубки. Поскольку нам все еще нужно контролировать скорость потока PBS, нам все еще нужен насос для шприца. Однако, поскольку кровь больше не течет, нам не нужно оставлять насос шприца в вертикальном положении, потому что в PBS нет клеток.

Итак, теперь все готово, и теперь мы смоем кровь с устройства, и я снова нажму острую кнопку прямо здесь. Итак, как вы можете видеть, устройство как бы начинает очищаться. На краях еще немного крови, но она потихоньку исчезает.

Поэтому, как только вся кровь уйдет, мы увеличим скорость с пяти микролитров в минуту до 20 микролитров в минуту. И причина этого изменения в том, что в крови на самом деле есть два типа клеток, которые имеют положительные антигены C4. Один из них — это то, что мы искали, Т-хелперные лимфоциты.

Другой — это то, что мы называем моноцитами. Мы хотим убедиться, что наше устройство улавливает только Т-хелперные лимфоциты, а не оба Т-хелперных лимфоцита и моноциты. И метод, который мы делаем, заключается в увеличении скорости потока, потому что мы знаем, что моноциты больше по размеру, чем Т-хелперы.

Таким образом, увеличивая скорость потока, более крупные моноциты будут испытывать большее давление, чтобы покинуть поверхность, чем четыре положительные Т-хелперы CD. Так что теперь это примерно за 20 минут. Так что сейчас у меня в руках решение.

Это называется решением для лицензирования факсов. Его целью для этого является лирование эритроцитов. Таким образом, где бы ни остались эритроциты в канале, этот раствор будет лежать именно на нем.

Это разводится в 10, 10 раз из исходного раствора. Итак, теперь мы остановим насос шприца, удалим трубку и заменим раствор на тот, что был из этого шприца. Итак, теперь я останавливаю машину, снимаю трубку, снимаю это, беру это с помощью этого шприца, заменяю его на новый.

Итак, теперь, когда у меня все настроено, мы уменьшим скорость до пяти микролитров в минуту. Итак, мы нажмем на скорость с 20, уменьшим ее до пяти, и теперь мы будем использовать решение для лицензирования факса в течение 20 минут. И теперь мы нажмем «Пуск».

Итак, прямо сейчас перед нами оптическое изображение устройства, сделанное при 10-кратном увеличении. Так что вы сами можете определить все эти белые точки здесь. Так как же мы можем убедиться, что именно эти клетки мы ищем?

Итак, мы используем несколько разных красителей, чтобы убедиться, что первое окрашивание, которое мы используем, является тем, что мы называем dpi, все это окрашивается в DPI, окрашивается в ядро. Так что, по сути, любые клетки с ядром, такие как белые кровяные тельца со всеми окрасками, в то время как, скажем, красные кровяные тельца, у которых нет ядра, не будут окрашены, и вы можете сказать, что это все на изображении. Они все эти синие точки, и каждая из них с синей.

является клеткой. Итак, теперь следующий шаг — проверить, есть ли в клетках то, что мы называем положительным антигеном С-4. Это чрезвычайно важно, потому что вся цель нашего устройства заключается в захвате С-4 положительных клеток.

Итак, следующее, флуоресцентное антитело, которое мы используем, конечно же, специфично для С-4. И переходим к следующему слайду. Итак, на этом рисунке клетки намного тусклее, потому что флуоресцентные антитела, которые мы обычно используем, используются для уточнения фактов.

Так что разбавление намного выше. Но если вы присмотритесь, вы все равно можете сказать, что вокруг этого вида поля все еще есть точки, которые разбросаны. Они довольно тусклые.

Но при ближайшем рассмотрении мы можем сказать, что эти клетки находятся в постоянном токе для положительного, и это хорошо, потому что это именно то, чего мы хотим. И следующий тест, как я уже упоминал ранее, заключается в том, что существует два различных типа С-4-положительных клеток. Одни из них — это те, в которых мы хотим видеть Т-хелперы, а другие — это то, что мы называем моноцитами.

Таким образом, нам снова нужно еще одно флуоресцентное антитело для дифференцировки между двумя клетками. Итак, мы знаем, что в Т-хелперных лимфоцитах есть то, что мы называем положительными антигенами CD 3. В то время как для моноцитов их нет.

Итак, следующее антитело, которое мы используем, это специфичное для CD 3, которое мы увидим на этом рисунке. Итак, опять же, вы можете сказать, что их точки разбросаны по всему устройству, они выглядят больше, потому что иногда некоторые клетки просто светятся ярче, некоторые нет. Я имею в виду, что в этом случае многое зависит от случая, но в большинстве случаев эти точки в ярко-красных точках — это все клетки.

Итак, опять же, мы просто хотим того, чего мы хотим, потому что, во-первых, убедиться, что наши клетки CD 4 положительны и CD 3 положительны. Так что в этом случае вы можете сказать, что многие наши клетки находятся в dCD 3-положительном, и это хорошо. Это дает нам специфику в нашей съемке.

Это может быть мусор, но во многих случаях происходит так, что иногда клетка просто случайно собирает больше CD трех смывов, CD 3 на себя. Итак, на этом рисунке это одна из данных, которые мы собрали для этого устройства для микрожидкости, и это в основном профессионал по захвату клеток. Итак, на предыдущем, знаете, слайдах и так далее, вы можете сказать, что там было много, знаете, картинок с клетками на них.

Но во что они на самом деле накапливаются? Ну, они накапливаются в профиль захвата ячейки, и в этом случае мы можем построить график по оси X, у нас есть расстояние от входа, а по оси Y у нас есть диск ячейки захвата. И вы можете сказать, что по всему устройству, вы знаете, ваша плотность сначала чрезвычайно высока, а затем медленно снижается, что мы и ожидаем, потому что мы захватываем С, четыре положительные и три po, С3 положительные клетки из кровотока, и они уменьшают концентрацию этих клеток в образце крови.

И в основном именно так обычно преподносятся наши данные.