Безлинзовой флуоресцентной микроскопии на чип

Общая цель этой процедуры — продемонстрировать безлинзовую платформу флуоресцентной микроскопии для визуализации флуоресцентных объектов в сверхшироком поле зрения. Для этого тонкий абсорбционный фильтр и оптоволоконная лицевая панель аккуратно помещаются поверх оптоэлектрического сенсорного массива или мха CCDC, а затем микрофлюидный чип размещается поверх лицевой панели. Затем призма собирается с микрочипом с помощью масла, соответствующего индексу.

Флуоресцентное цитирование достигается через боковую грань ромбовидной призмы, а голографическое освещение осуществляется через верхнюю грань той же призмы. В конечном счете, микроскопические изображения с высоким разрешением могут быть получены из полученных флуоресцентных изображений путем декодирования необработанных изображений с помощью цифровых алгоритмов. При необходимости декодированные флуоресцентные объекты могут быть автоматически подсчитаны с помощью специально разработанного интерфейса.

На чипе объектива. Визуализация в целом направлена на замену громоздких оптических микроскопов на основе объективов более простыми и компактными конструкциями. Эта новая технологическая платформа обладает потенциалом для устранения необходимости в громоздких и дорогостоящих компонентах привлекательности с помощью новых теорий и алгоритмов цифровой реконструкции.

Список объективов на интегрированной платформе визуализации включает в себя несколько оптических компонентов, включая цифровую матрицу датчиков, источник некогерентного освещения, призму, поглощающий фильтр и оптоволоконную лицевую панель или оптоволоконный конус. В этой платформе можно использовать различные типы сенсорных матриц для обнаружения флуоресцентного сигнала от целевых микрообъектов. Для целей этого видео будет использоваться устройство с зарядовой связью, а для возбуждения флуоресценции используется некогерентный источник света, такой как простой светоизлучающий диод.

Два различных метода фильтрации возбуждения используются параллельно для создания необходимого фона темного поля, как показано на этой диаграмме. Во-первых, стеклянная призма или стеклянная полусфера используется для создания полного внутреннего отражения или TIR на нижней поверхности микрофлюидного чипа, в котором размещены интересующие образцы. Параллельно с этим используется недорогой абсорбционный фильтр для удаления еженедельно рассеянных огней возбуждения, которые не подчиняются процессу МДП.

При успешном подавлении возбуждения с помощью этих двух механизмов в плоскости детектора регистрируется только флуоресцентное излучение образцов. Несмотря на такую большую числовую апертуру обнаружения, необработанные флуоресцентные пятна на сенсорной решетке становятся довольно широкими, чтобы спроектировать и лучше контролировать пространственное распространение этого флуоресцентного сигнала. Оптоволоконная лицевая панель будет размещена между объектом и сенсорными плоскостями в качестве альтернативы обычной лицевой панели.

Коническая оптоволоконная лицевая панель, которая имеет значительно большую плотность волоконно-оптических кабелей на верхней грани по сравнению с нижней, может быть использована для получения изображений с более высоким разрешением за счет увеличения. Микрофлюидные чипы, используемые в этой платформе, изготовлены с использованием полидиметилслоунских стенок, размещенных на стеклянных предметных стеклах для создания микроканалов, необходимых для визуализации на кристалле, чтобы начать сборку безземельной платформы визуализации на кристалле. Сначала снимите защитное стекло оптоэлектронной сенсорной матрицы с помощью вакуумной ручки, аккуратно поместите тонкий абсорбционный фильтр на верхнюю часть активной зоны детектора.

Поместите волоконно-оптическую лицевую пластину поверх этого абсорбционного фильтра. Затем поместите изготовленный микрофлюидный чип непосредственно на оптоволоконную решетку. Затем стеклянная призма собирается над микрофлюидным чипом, соответствующим индексу масла, таким образом, что показатель преломления границы соответствует показателю преломления стекла.

Подключите источники света к оптоволоконным кабелям с помощью разъемов FC. Одним из самых сложных аспектов этой процедуры является выравнивание компонентов. Тщательно выровняйте расстояния между компонентами, положение и угол подсветки.

Наконец, переместите боковое световое волокно ближе к призме и отрегулируйте его угол, чтобы обеспечить полное внутреннее отражение на границе стеклянного воздуха, соответствующей микрофлюидным чипам. Нижний субстрат, различные клетки или модели мелких животных могут быть визуализированы с помощью этой платформы на чипе, но для целей этой демонстрации будут визуализированы белые кровяные тельца. Чтобы пометить лейкоциты флуоресцентным красителем, сначала смешайте около 100 микролитров цельной крови с примерно одним миллилитром буфера для подъема эритроцитов, инкубируйте около трех минут при комнатной температуре, затем центрифугируйте раствор крови.

После удаления верхнего слоя с помощью микропипетки повторно суспендируйте слой гранул в фосфатно-солевом буфере, чтобы пометить нуклеиновую кислоту клеток флуоресцентным красителем, добавьте SYTO 16 в реактивную суспензию и затем инкубируйте образец в течение примерно 30 минут в темноте при комнатной температуре. Через 30 минут центрифугируйте помеченный образец. Удалите супинат, чтобы уменьшить фоновый шум из-за флуоресцентного излучения несвязанных красителей.

Риз согнул слой гранул лейкоцитов примерно в пяти миллилитрах PBS. Теперь образец готов к загрузке в микрофлюидный чип для флуоресцентной визуализации без линз на чипе. Перед визуализацией лейкоцитов платформа визуализации должна быть откалибрована с использованием флуоресцентных микрогранул.

Приготовьте разведенный образец микрогранул с использованием деионизированной воды и сырого раствора гранул. С помощью острой иглы шприца. Введите этот первоначальный образец в микрофлюидный чип со стороны стенок PDMS.

После сборки компонентов для получения флуоресцентной визуализации на кристалле получите необработанные изображения флуоресцентных шариков с помощью специально разработанного интерфейса лабораторного просмотра с помощью компьютера. Убедитесь, что во всем поле зрения имеется не менее 20 изолированных изображений флуоресцентных шариков. Сохраните данные калибровки, которые позже будут использованы для калибровки и извлечения функции расширения точки платформы флуоресцентной микроскопии без линз.

Извлеките микрофлюидный чип, содержащий образец флуоресцентного шарика, и отсоедините призму от этой микросхемы. Введите ранее подготовленный образец лейкоцитов в другой неиспользованный микрофлюидный чип со стороны стенок PDMS. Соберите компоненты еще раз в тех же экспериментальных условиях, особенно в отношении расстояний и мощности возбуждения.

Получите исходные изображения белых кровяных телец с помощью специально созданного лабораторного просмотра с теми же параметрами программного обеспечения, которые используются для флуоресцентных микрогранул. Данные калибровки и необработанные изображения лейкоцитов затем используются для создания изображений с более высоким разрешением в MATLAB с помощью цифровой обработки. Репрезентативные результаты широкоугольной линзовой флуоресцентной визуализации на кристалле смеси, содержащей зеленые флуоресцентные частицы размером четыре микрона и 10 микрон, показаны здесь для сравнения с помощью 10-кратного микроскопа.

Также предоставляются объективные изображения, которые хорошо согласуются с показанными изображениями с менее флуоресцентным изображением объектива. Далее приведены результаты широкоугольного объектива, менее флуоресцентного изображения смеси, содержащей 10 мкм зеленых и 10 мкм красных флуоресцентных частиц. Безлинзовые флуоресцентные изображения обеспечивают достойное соответствие изображениям тех же образцов с объективом 10-кратного микроскопа.

На этом рисунке представлено сравнение производительности деконволюции Люси Ричардсон и компрессионной выборки на основе алгоритмов декодирования для визуализации различных 10-микронных пар шариков. В верхнем ряду показаны объективные необработанные флуоресцентные изображения, на которых встроенные изображения показывают микроскопические сравнения тех же частиц, которые требуются при использовании объектива с 10-кратным увеличением. Средний ряд демонстрирует результаты сжатого декодирования, в то время как нижний ряд иллюстрирует результаты деконволюции Люси Ричардсон: DDCS и DLR относятся к расстояниям от центра к центру и изображениям микроскопа, изображениям декодированных объективов CS и изображениям LR de без кривизны объектива соответственно.

Далее иллюстрируется цифровая обработка объектива, менее флуоресцентные необработанные изображения. Алгоритм, основанный на сжатой выборке, используется для достижения пространственного разрешения менее четырех микрон за счет разрешения тесно упакованных пар бусин диаметром два микрона. На врезках показаны 40-кратные сравнения объективов микроскопа, которые очень хорошо согласуются с расшифрованными флуоресцентными изображениями.

Здесь D относится к расстояниям от центра к центру на изображениях микроскопа. В то время как DCS относится к межцентровым расстояниям в декодированном объективе CS, флуоресцентные изображения меньше. На этом рисунке показаны результаты визуализации флуоресцентно меченных белых кровяных телец без хрусталика.

Необработанные изображения без линз быстро декодируются с помощью декодера на основе CS, который очень хорошо согласуется с обычным микроскопическим изображением того же образца, полученным с помощью объектива с 10-кратным увеличением. В дополнение к визуализации, если это необходимо, декодированные флуоресцентные объекты также могут быть автоматически подсчитаны с помощью специально разработанного интерфейса для приложений цитометрии на кристалле. Мы только что продемонстрировали процедуру безземельной флуоресцентной микроскопии меченых клеток и микроударов в поле зрения в восемь квадратных сантиметров.

Такое сравнение судовой платформы съемки с быстрым компрессионным дешифратором позади. Он будет весьма вариативным для высокопроизводительной цитометрии, микроредкого анализа и реальных клеточных исследований.