Изучение актинового цитоскелета в клетках эндотелия Живая выражая GFP-актин

Целью данной процедуры является наблюдение за динамическими изменениями актинового цитоскелета в живых эндотелиальных клетках. Сначала проведите трансфекцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека плазмидой A GFP beta actin и культивируйте их на покровных стеклах до достижения конфлюэнтности. Затем поместите покровные стекла в камеру для визуализации живых клеток с подогреваемым столиком и инфузией физиологического раствора с альбумином.

Заключительным этапом является сбор данных по выбранному участку клеток с помощью таймлапс-съемки до и после воздействия фармакологического агента. Анализ графиков с использованием программного обеспечения для обработки изображений, такого как Image J, позволяет получить сведения о локальных выпячиваниях ламеллоподий, таких как расстояние, время и скорость их образования, а также о перемещении актиновых волокон с течением времени. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как иммунофлуоресцентная визуализация, является то, что визуализация живых клеток позволяет учитывать динамическую природу актинового цитоскелета при изучении механизмов, определяющих проницаемость эндотелия.

В то время как клетки с фиксированным окрашиванием представляют собой мгновенные снимки и дают мало информации о динамике актина и цитоскелета до и после обработки воспалительным медиатором, в шкафу биологической безопасности стерилизуйте покровные стекла в 70% ethanol в течение двух минут, а затем высушите их на воздухе. Поместите каждое покровное стекло в 10 сантиметровую культуральную чашку и добавьте 300 microliters теплого раствора желатина в центр, не касаясь краев покровного стекла. Через пять минут аспирируйте жидкость.

Теперь соберите конфлюэнтную культуру эндотелиальных клеток пупочной вены человека (VE), используя 0,25% раствор трипсин-ЭДТА. Подсчитайте количество клеток и осадите их путем центрифугирования. Максимально удалите супернатант среды для проведения реакции трансфекции с использованием набора для трансфекции ядер эндотелиальных клеток (VE nuclear effector kit).

Ресуспендируйте осадки клеток в базовом растворе ядерного эффектора и добавьте от 0,2 до 2 мкг плазмидного вектора GFP бета-актина. Перенесите 100 µL клеточной суспензии в кувету для ядерного эффектора. Несколько раз постучите по закрытой кувете, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха между дном куветы и образцом для трансфекции.

Поместите Q VET в устройство nuclear effector two и запустите программу A 0 3 4, перенеся с помощью трансфер-пипетки из набора nuclear effector kit 500 µL подогретой среды EGM two MV в qve. Затем перенесите смесь обратно в микроцентрифужную пробирку и инкубируйте в течение 15 минут. Осторожно однократно перемешайте суспензию трансфицированных VE и нанесите 300 µL суспензии на покрытое желатином покровное стекло, не касаясь его краев.

Затем инкубируйте от одного до четырех часов. Осмотрите трансфицированные клетки, чтобы подтвердить их прикрепление к покровному стеклу. Затем добавьте в лунку 10 milliliters среды E GM two MV и продолжите инкубацию для экспрессии GFP.

Сначала залейте среду физиологического раствора с альбумином (PSS) в систему гравитационного потока и подключите ее к встроенному нагревателю. Затем отрегулируйте регулятор потока, чтобы достичь скорости примерно 40 milliliters per hour. После этого остановите поток, закрыв стоп-кок с помощью аппликатора с ватным наконечником.

Нанесите вакуумную смазку на внешний край нижней стороны алмазной кюветы. Затем извлеките культуру с трансфегированными клетками из инкубатора. Осторожно поднимите покровное стекло с помощью пинцета.

Затем с помощью салфетки Kimwipe удалите излишки среды EGM two MV с нижнего предметного стекла, расположив его клетками вверх. Поместите алмазную кювету поверх покровного стекла для создания камеры. Быстро установите камеру в нагреватель предметного столика.

Затяните зажимы над камерой и с помощью пипетки перенесите примерно 1 ml среды EGM two MV из планшета в камеру. Теперь подсоедините вакуумный шланг к держателю с левой стороны камеры, а линию A PSS от встроенного нагревателя к каналу с правой стороны камеры. Затем включите вакуум и откройте линию A PSS для обеспечения перфузии ванны над трансфецированными клетками.

Также включите встроенный нагреватель, установив температуру 37 °C. Затем поместите терморезистивный датчик подогреваемого предметного столика в ванну по краю и включите нагреватель столика на 37 °C. Чтобы удалить остатки среды EGM two MV и накопившиеся соли, осторожно протрите нижнюю сторону покровного стекла салфеткой Kim wipe, смоченной в 70% ethanol, а затем сухой салфеткой Kim wipe. Инкубируйте трансфецированные клетки HU в течение 30 минут для уравновешивания.

Заблокируйте перемещение по курсу. Сфокусируйтесь на выбранном участке культуры клеток для исследования. Установите время экспозиции камеры в диапазоне от 0.5 до двух секунд, в зависимости от интенсивности сигнала GFP Act в клетках.

Также установите интервал и продолжительность эксперимента. Теперь при выключенном комнатном освещении сделайте один снимок для оценки настроек. Запустите серию таймлапс-съемки, контролируя получаемые изображения по мере необходимости.

В стандартном протоколе следует получить базовые изображения в течение 20–30 минут перед добавлением исследуемого агента, после чего продолжить сбор изображений в течение от 0,5 до четырех часов. В завершение, как подробно описано в сопроводительном тексте, оцените расстояние протрузии, устойчивость и скорость ламеллиподий с помощью анализа графиков CH. В типичном эксперименте GFP-актин экспрессируется более чем в 50% трансфицированных VE случайным образом.

На этих изображениях, полученных с интервалом в одну минуту, зафиксирован GFP-актин во всей цитоплазме, а также в филаментозных структурах и локальных мелиподиях, выступающих вдоль края клетки. Стойкость расстояния и скорость клеточных выступов количественно определяются на основе наборов изображений, полученных методом таймлапс-микроскопии. С помощью анализа графиков kym graph сначала проводится линия в один пиксель приблизительно перпендикулярно краю клетки.

Эта область извлекается из каждого изображения серии таймлапс-съемки для создания монтажа этой области во времени или хронографика (chime graph). На данном хронографике, при рассмотрении слева направо, выступы представлены в виде движений края клетки вверх. Когда линия накладывается на край одного из таких выступов, можно собрать данные о пикселях, связанных с этой линией, для количественного анализа динамики выступов. Общее количество выступов на хронографике может быть использовано для оценки частоты появления выступов.

Данный анализ отображает перемещение стресс-фибрилл, которые формируются у периферии клетки и движутся к ее центру, где в конечном итоге распадаются. На kym-графе стресс-фибриллы выглядят как непрерывные линии в цитоплазматической области, часто смещающиеся вниз и вправо по направлению к центру клетки; в случаях, когда фибриллы плохо видны на исходном kym-графе, фильтр «контурная резкость» (unsharp mask) делает изображение более четким. Линии, проведенные по стресс-фибриллам, облегчают сбор данных о пикселях с помощью функции измерения. В качестве альтернативы линии, проведенные от начала до конца идентифицированной стресс-фибриллы, позволяют рассчитать среднее значение данных по пикселям за весь период наблюдения за данной фибриллой.

В данной презентации было продемонстрировано, как анализировать данные набора изображений таймлапс-съемки с помощью графического анализа в таком программном обеспечении, как Image J. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изучать динамику актинового цитоскелета в ответ на воспалительные медиаторы, используя прижизненную визуализацию трансфецированных эндотелиальных клеток.