Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Общая цель данной процедуры заключается в выделении и культивировании первичных стволовых клеток нейрального гребня (N CSCs) из тканей кожи головы человека. Это достигается путем первоначального разрезания кожи головы человека на полоски шириной один сантиметр и их инкубации в среде, содержащей дис-баи. Затем кожу помещают в свежую среду и проводят эксцизию волосяных фолликулов.

На втором этапе процедуры волосяные фолликулы обрабатывают трипсином для получения суспензий из единичных клеток. Заключительный этап процедуры состоит в сортировке CD 2 71 HNK one двойных положительных ncsc с помощью проточной цитометрии и их посеве в культуральные планшеты. В конечном итоге для изучения формирования и роста нейросфер используется фазово-контрастная микроскопия. Демонстрация этих методов имеет решающее значение, так как этапы извлечения и изоляции волосяных фолликулов сложно освоить из-за трудности препарирования кожи и волосяных фолликулов под микроскопом.

Для подготовки к культивированию стволовых клеток покройте дно каждой лунки планшета на 6 лунок поли-D-лизином и дайте планшетам высохнуть в ламинарном шкафу. После высыхания лунок промойте их стерильной водой и аспирируйте содержимое, затем снова дайте лункам высохнуть. Покройте планшеты раствором фибронектина в концентрации 0,17 mg/mL.

Затем, пока фибронектин высыхает в планшете с культурной средой NCSC, приготовьте следующие среды и реагенты: 97% D-M-E-M-F 12, 2% добавки B 27, 1% и две добавки B-F-G-F-E-G-F IGF one и diss. Возьмите свежий образец кожи волосистой части головы взрослого человека, полученный в ходе подтяжки лица, или ткань волосистой части головы плода и промойте ее PBS, содержащим пенициллин-стрептомицин.

Перенесите кожу в пробирки объемом 50 мл и инкубируйте в среде DMEM с 10 мг/мл DIS при 37 °C в течение двух-четырех часов или в течение ночи при 4 °C. Затем перенесите кожу в стерильную чашку Петри и удалите волосы с кожи, захватив стержень волоса у поверхности кожи и с силой плавно вытянув его. Волосные фолликулы будут иметь морфологию антигенного органа; инкубируйте изолированные фрагменты фолликулов в 0,05% трипсине-ЭДТА в течение 15–20 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая пробирку.

Затем добавьте 4 мл DMEM с 10% FBS, чтобы остановить реакцию. Далее пропустите фолликулярный эпителий через фильтр с размером пор 40 мкм для получения суспензии из отдельных клеток различного размера и формы. После этого центрифугируйте суспензию при 200 ×g в течение пяти минут.

Осторожно удалите супернатант S и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре PBS с 2% FBS. Для выделения N CSCs методом FACS сначала пометьте клетки антителами: PC-конъюгированным CD 2 71, FE C-конъюгированным hnk one или CD 2 71 PE-конъюгированным alpha four integrin, инкубируя их на льду в течение 40 минут в темноте; центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре и аспирируйте супернатант. Ресуспендируйте клетки в PBS, содержащем 2% FBS и два микрограмма на миллилитр пропидия иодида, для отсечения мертвых клеток.

Выполните сортировку клеток методом проточной цитометрии и соберите культуру клеток, являющихся двойными положительными по CD 2 71 H и K one или двойными положительными по CD 2 71 и α4-интегрину. Посейте клетки в планшеты с ультранизкой адгезией в среде NCSC, заменяя среду один раз в день. Ежедневно контролируйте клеточную культуру под микроскопом.

Через несколько дней в культуре NCSC начнут образовывать плавающие мелкие агрегаты, а через две-пять недель — сформированные сферы, в зависимости от возраста доноров. При культивировании целых волосяных фолликулов в среде для NCSC через несколько дней в области луковицы появятся выросты, а через несколько недель — сформированные сферы in situ. Для экспансии культур NCSC один раз промойте клетки PBS, предварительно нагрев трипсин-ЭДТА до 37 °C.

Затем добавьте раствор к клеткам на 7–15 минут, чтобы стволовые клетки волосяного фолликула открепились. Чтобы остановить действие трипсина, добавьте DMEM с 10% FBS и осторожно пропипетируйте смесь вверх и вниз для диспергирования клеток. Затем центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут.

Перевзвесьте клетки в среде для NCSC и культивируйте на планшетах, покрытых фибронектином, при 37 °C. Среда для культивирования NCSC достаточна для поддержания человеческих NCSC в недифференцированном состоянии.

В отсутствие фидерных клеток кератиноциты не будут пролиферировать и постепенно погибнут в среде. Некоторые мелкие округлые клетки будут пролиферировать и образовывать в суспензии небольшие агрегаты. Через три-пять дней эти плавающие агрегаты будут медленно увеличиваться в размере, образуя трехмерные сферические структуры, называемые волосяными сферами.

При культивировании на кодированных планшетах N CSCs прикрепляются к поверхности и растут быстрее, чем клетки, образующие сферы в суспензии; как сферы, так и прикрепленные стволовые клетки экспрессируют маркеры NCSC. При культивировании целых волосяных фолликулов сферы образуются в области, соответствующей зоне выпячивания (bulge). После просмотра видео вы должны получить четкое представление о методах изоляции и культивирования.

Первичные нейральные стволовые клетки из тканей скальпа гермалинтевых животных.