Обнаружение и Genogrouping норовирусов от стулья Детский По Taqman один шаг RT-PCR

Обнаружение нейровируса в экстрагированной РНК методом R-T-P-C-R в реальном времени с помощью специальных зондов TECHMAN. Но сегодня мы поговорим о нейровирусе. Это в Лиме, Перу, и это группа университета, а также Университета Джона Хопкинса.

Норовирус, оказывается, вероятно, является одной из забытых мостеками причин диареи. Наша группа обнаружила, что норовирус занимает второе место по количеству госпитализаций детей по поводу диареи, а также по количеству случаев диареи среди населения. Так почему же НЕЙРОВИРУС не был диагностирован раньше?

Причина в том, что это РНК-вирус, и мы не можем его культивировать, поэтому для диагностики требуются специальные молекулярно-биологические методы. Мы используем эти методы R-T-P-C-R, и это продемонстрирует, как использовать и диагностировать, как использовать R-T-P-C-R для диагностики нейровируса. В 1989 году мы использовали собственный метод Ciag GUINE ATE для выделения вирусной РНК из образцов кала.

Этот метод является альтернативой коммерческому набору вирусной РНК caamp. Оба метода основаны на связывающих нуклеиновых кислотах частицах диоксида кремния. В сочетании с антинуклеазными свойствами G Guad Dium Bio NA препарат суспензии диоксида кремния для экстракции РНК.

Чтобы приготовить частицы кремнезема, возьмите 30 грамм диоксида кремния, добавьте 250 миллиметров деминерализованной воды и суспензируйте кремний путем встряхивания. После 24 часов отстаивания удалите 215 миллилитров супината и порцию путем всасывания 250 миллилитров деминерализованной воды и снова суспензируйте кремний, встряхивая. Еще через 24 часа удалите супинат путем всасывания и отрегулируйте pH суспензии кремнезема до pH 2,0 с помощью соляной кислоты qu суспензии диоксида кремния в стеклянных бутылках и автоклавной экстракции с g guin и диоксидом кремния.

Теперь мы рассмотрим экстракцию вирусной РНК с использованием частиц кремнезема, приготовленных на предыдущем этапе. Хранить при температуре минус 70 градусов Цельсия до использования. Для приготовления 10%-ной фекальной суспензии берут примерно 0,1 грамма кала и запивают одним миллилитром PBS перед экстракцией.

Опустите загрузку образцов на пять секунд, а затем центрифугируйте при 4 000 об/мин в течение 10 минут. В каждой реакции образец кала с положительным результатом на нейровирус в качестве положительного контроля и воду, обработанную DEPC, в микроцентрифужной пробирке. Смешайте следующее, один миллилитр L шести буфера, 20 микролитров подготовленных частиц диоксида кремния и 200 микролитров калового экстракта.

и оставьте образцы при комнатной температуре на 15 минут. Центрифугируйте в течение 15 секунд. Затем промойте гранулу дважды с буфером L два, затем две промывки с 70% этанолом и одну промывку с кислотой.

Сушите пеллеты в сухом нагревательном блоке при температуре 56 градусов Цельсия в течение пяти минут. Гидратируйте РНК в грануле диоксида кремния, добавив 50 микролитров дистиллированной воды, свободной от РНК. Добавьте один микролитр РНК sin vortex и оставьте при температуре 56 градусов Цельсия на 15 минут.

Сороконожку в течение трех минут на полном ходу набирают супинатную температуру, содержащую РНК. Количественно оцените образцы методом без капель и храните извлеченную РНК при температуре минус 70 градусов Цельсия. До использования используется коммерческая экстракция вирусной РНК.

Теперь мы собираемся продемонстрировать экстракцию РНК из стула с использованием коммерчески доступной вирусной РНК kay amp. Набор содержит следующий силикагель MinPin колоночный буфер, A-V-L-A-W один W2 A VE и листовидную РНК-носитель. Кратко. Порядок действий следующий.

Смешайте порцию буфера А VL с несущей РНК и вихревой трубкой в растворе в 1,5 миллилитровых пробирках при 114 микролитрах стуловой суспензии и перемешайте послевоенным текстовым сообщением. Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут. Импульсное центрифугирование образцов.

Добавьте этанол в образцы и перемешайте, отправляя послевоенные текстовые сообщения в течение 15 секунд. Затем кратковременно центрифугируете, нанесите раствор на спиновую колонку в две минимально сборные пробирки. Тяните фугу.

Затем поместите спиновую колонку в новую трубку для сбора. Промыть колонку связанной РНК с помощью буфера A W без центрифуги-носителя RAN. Поместите колонку в чистую двухмиллилитровую пробирку для сбора и следите за колонкой с буфером.

Центрифуга W2 на полной скорости помещает штифтовую колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугирует на полной скорости. И увеличьте РНК с помощью буфера VE для хранения вирусной РНК при температуре минус 70 градусов Цельсия до тех пор, пока не используйте обнаружение нейровируса в экстрагированной РНК методом ПЦР в реальном времени с помощью специальных зондов технарем, чтобы сделать мышиную смесь для первой группы генов и группы Дина второй, держите смесь ферментов RT на льду во время анализа. Набор Set to содержит следующую воду PCO, два яйца, праймеры и зонды для Dina.

Прайс-группы и щуп первой группы для Dina Group two. И, наконец, фермент RT смешивают вихревой реагент H перед использованием QU для ПЦР воды, мастер смешивают два X праймера кокса G один прямой и обратный и зондовое кольцо один A и один B для UniGroup. Одна мышечная смесь и подготавливает COG G, две для VA verse и зонда.

Кольцо два для мастер-микса Theo Group two. И, наконец, добавьте фермент artix в обе мышечные смеси группы INO. Вортекс и алко по 10 микролитров соответствующей мышечной массы смешайте в реакционные лунки.

В другой шкаф добавьте пять микролитров неразбавленной РНК, пять микролитров РНК, G 1 и две положительные контрольные РНК и пять микролитров отрицательного контроля к соответствующим реактивным колесам. Центрифугу истощают в течение 10 секунд при 6 000 г. На этом шаге одно программное обеспечение показывает расширенные настройки.

А на экране свойств эксперимента эксперимент идентифицируется как норовирус. Тип эксперимента — это присутствие или отсутствие на целевом экране. Введите название мишени, которую вы хотите обнаружить, в реакционную пластину ПЦР.

Джина, репортер первой и второй группы и тушитель Тамара на образце и тиражном экране. Введите количество образцов и положительных и отрицательных контрольных точек, включенных в реакционную пластину, а затем выберите, какие образцы или целевое направление следует настроить для параметра Метод In run. Сначала проводят обратную транскрипцию при температуре 50 градусов Цельсия для синтеза комплементарной ДНК.

Затем поднимите температуру до девяти-пяти градусов Цельсия, чтобы активировать полимеразу горячего старта. Начните цикл по продолжительности при девяти-пяти градусах Цельсия, за которым следует комбинированный шаг с коленом и усилением при 60 градусах Цельсия. Повторите цикл четыре-пять раз, вернитесь в положение пластины.

Нажмите кнопку Сохранить шаблон и сохраните эксперимент. Нажмите «Начать запуск». Экран графика усиления позволяет просматривать усиление образца по мере того, как прибор собирает замороженные данные во время прогона, а также контрастность графика.

Нормированная флуоресценция погружения и номер цикла. В начальных циклах ПЦР наблюдается незначительное изменение флуоресцентного сигнала. Это определяет базовую линию.

Увеличение флуоресценции относительно базовой линии указывает на обнаружение накопленной цели. Фиксированный порог флуоресценции должен быть установлен относительно базового уровня. Параметр CT threshold cycle определяется как число дробных циклов, при котором флуоресценция превышает фиксированный порог.

Экран графика амплификации полезен для идентификации и изучения аномальной амплификации, такой как повышенная флуоресценция в отрицательных контрольных лунках и отсутствие обнаруживаемой флуоресценции в ожидаемом цикле. Китовый метод надежен, но требует огромного количества времени и ресурсов. Здесь мы показали столь же надежный метод, который является экономически эффективным и использует легкодоступные в стране реагенты, минуя зависимость от материалов, закупаемых за рубежом, что в конечном итоге приведет к более доступной диагностике и быстрому лечению наиболее распространенных вирусных причин гастроэнтерита у детей. которые получили результаты, аналогичные тем.

Получен с помощью коммерческого набора от Kerogen, вместе с TAC MAN, R-T-P-C-R, который был разработан в нашей лаборатории. Мы можем обнаруживать широкий спектр нейровирусной инфекции. Этот анализ оказался полезным для рутинной диагностики, поскольку он исключает обработку продукта после амплификации, тем самым сокращая время анализа.

Помимо диагностики, протокол также может быть использован для уточнения эпидемиологии нейровирусной инфекции, что полезно для контроля общественного здравоохранения за этим заболеванием.