Продольные Оценка Мышь Задние потери костной массы конечности после Травма спинного мозга с использованием новых, В естественных условиях Методология

В данной процедуре представлен новый метод, используемый для выявления и количественной оценки потери плотности костей задних конечностей мыши в зависимости от времени после травмы спинного мозга. Сначала под стерильными условиями, одобренными комитетом ALAC, мыши в состоянии анестезии наносят травму путем перерезки спинного мозга. Затем, после периода восстановления, животное повторно подвергают анестезии и делают рентгеновские снимки большеберцовой и малоберцовой костей обеих правых и левых задних конечностей.

Данная процедура проводится еженедельно в течение 40 дней после получения травмы. Затем выполняется анализ изображений рентгенограмм. Заключительным этапом является посмертная оценка плотности кости иссеченных костей задних конечностей.

В конечном итоге, результаты показывают, как травма спинного мозга вызывает быструю и прогрессирующую потерю плотности костной ткани в задних конечностях мыши. Этот новый метод обеспечивает высокое пространственное и временное разрешение, используя более низкие дозы рентгеновского излучения, чем другие методы визуализации. Остеопороз представляет собой опасное для жизни состояние, которое развивается у людей с травмой спинного мозга.

Мы предлагаем новый метод для использования в исследованиях травм спинного мозга на животных, который позволяет исследователю в течение длительного времени осуществлять лонгитюдное наблюдение за потерей костной массы, связанной с остеопорозом. Это важно по двум причинам. Во-первых, данный метод предоставит возможность изучить механизмы, определяющие развитие остеопороза.

Во-вторых, это дает нам возможность тестировать новые методы вмешательства, направленные на предотвращение или, возможно, обращение вспять развития остеопороза у пациентов с травмой спинного мозга. Хотя данный метод позволяет изучить остеопороз, индуцированный травмой спинного мозга, он также может быть применен к другим состояниям, таким как возрастная потеря костной массы у женщин в период постменопаузы, а также к другим случаям снижения плотности костей вследствие травм; например, отсутствие нагрузки на конечности из-за иммобилизации после переломов или других повреждений может привести к существенной потере костной массы в процессе заживления. Применение продольного рентгеновского исследования целого животного с низкой дозой облучения может открыть новые пути разработки методов терапии, направленных на минимизацию или предотвращение этих проблем.

Выполните операцию по повреждению спинного мозга согласно процедурам Сандера и в соответствии с рекомендациями местного институционального комитета по уходу и использованию животных. Затем, начиная с 10-го дня после операции на спинном мозге и далее с интервалом в 10 дней до 40-го дня, проведите обследование правых и левых бедренных и большеберцовых костей живых анестезированных животных с перерезанным спинным мозсом и контрольной группы здоровых животных соответствующего возраста с помощью сканирования системой ivus Lumina XR; перед началом сканирования инициализируйте устройство Lumina XR, чтобы внутренняя камера достигла рабочей температуры минус 90 °C.

Поместите анестезированное животное на платформу внутри системы Lumina xr. Затем установите объектив с большим увеличением, чтобы обеспечить фокусировку как на области бедренной, так и на области большеберцовой кости. Убедитесь, что объект правильно расположен в поле зрения.

При необходимости откройте дверцу и измените положение животного. Правильное положение животного показано здесь. После того как животное будет правильно расположено, можно выполнить рентгенографию.

Выберите в выпадающем списке энергию, подходящую для животных. Затем откройте панель управления. Активируйте функцию рентгена, установив флажок «x-ray», и получите рентгеновское изображение.

Вся бедренная и большеберцовая кости должны быть видны, как показано здесь. Поскольку программное обеспечение для визуализации в реальном времени по умолчанию отображает преобразованные рентгеновские изображения, убедитесь, что отображаются исходные рентгеновские снимки: для этого перейдите в меню инструментов фильтрации коррекции и снимите флажок рядом с пунктом «x-ray absorption». Исходные данные изображения автоматически сохраняются на жесткий диск.

Также сохраняются репрезентативные файлы в формате TIFF. После визуализации мышь возвращают в домашнюю клетку, где она восстанавливается под наблюдением исследователя. Затем процедура повторяется со следующей мышью.

Сначала запустите программное обеспечение, дважды щелкнув по иконке living image в появившемся диалоговом окне. Выберите нужную папку и нажмите OK. Загрузите рентгеновский снимок, нажав кнопку «Обзор» (browse).

В браузере живых изображений отображаются выбранные данные вместе с идентификатором пользователя. Информация о метках и конфигурации камеры. Чтобы открыть данные, дважды щелкните по строке данных. Отобразится изображение и палитра инструментов.

Открытые данные выделены в браузере синим цветом. Затем нажмите на инструменты ROI. В палитре инструментов ROI откройте выпадающий список типов и выберите ROI измерения.

Чтобы загрузить три области интереса (ROI), используемые в данном эксперименте, нажмите на значок квадрата и загрузите квадраты. С помощью линейки измерьте длину бедренной кости, затем отрегулируйте длину двух квадратов так, чтобы она составляла одну восьмую от общей длины бедренной кости. Отрегулируйте ширину квадратов так, чтобы она составляла одну двадцать четвертую часть от общей длины бедренной кости.

Теперь с помощью линейки отмерьте одну восьмую расстояния от проксимального конца бедренной кости и расположите один прямоугольник так, чтобы он был центрирован в этой позиции. Переместите второй прямоугольник к дистальному концу бедренной кости и расположите его так, чтобы он находился по центру трабекулярной области коленного сустава. Затем измерьте длину большеберцовой кости.

Установите длину прямоугольника равной одной восьмой от общей длины большеберцовой кости. Установите ширину равной одной тридцатой от общей длины большеберцовой кости. Наконец, расположите прямоугольник так, чтобы он находился по центру и на расстоянии одной восьмой от общей длины большеберцовой кости от проксимального конца большеберцовой кости, как показано здесь.

Затем нажмите на значок измерения; на рентгеновском изображении отобразятся измерения интенсивности ROI, и появится таблица измерений ROI. Экспортируйте эту таблицу в нужное место в виде файла CSV с разделителем-точкой. Это позволит открыть таблицу с помощью Excel.

Повторите этот шаг для всех сохраненных изображений, подлежащих анализу. В завершение объедините все данные в один лист Excel. Статистическая значимость определяется с помощью t-критерия Стьюдента с использованием такого программного обеспечения, как Microsoft Excel или Sigma Plot 11.0; при желании результаты можно сравнить с данными, полученными в ходе посмертного анализа плотности костной ткани методом двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии, используя стандартные протоколы для этого метода.

С помощью вышеописанного метода можно обнаружить относительную потерю плотности костей большеберцовой и бедренной костей мыши после повреждения спинного мозга по сравнению с наивными мышами. На данном рисунке показана потеря плотности костной ткани в проксимальном отделе большеберцовой кости через 10, 20, 30 и 40 дней после травмы. По сравнению с контрольной группой наивных животных соответствующего возраста, уже через 10 дней наблюдается значительное снижение плотности большеберцовой кости на 12%, а к 40-му дню потеря плотности костной ткани достигает 15%.

Здесь представлена потеря плотности костной ткани в проксимальном отделе бедренной кости после травмы спинного мозга через 10, 20, 30 и 40 дней после повреждения. По сравнению с контрольной группой здоровых животных соответствующего возраста, на 40-й день после травмы наблюдалось снижение плотности костной ткани в проксимальном отделе бедренной кости на 7%. На данном графике показана потеря плотности костной ткани в дистальном отделе бедренной кости через 10, 20, 30 и 40 дней после травмы спинного мозга.

По сравнению с наивным контролем соответствующего возраста, снижение плотности костной ткани в дистальном отделе бедренной кости наблюдалось уже через 10 дней после травмы и сохранялось на протяжении всего остального периода эксперимента. На этом репрезентативном изображении данных двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии показаны показатели содержания и плотности минеральных веществ кости. Извлеченные бедренные кости были проанализированы через 40 дней после травмы спинного мозга.

Для сравнения эффективности метода, продемонстрированного в данном протоколе, с другими доступными на данный момент методами, на этом рисунке представлен анализ содержания минеральных веществ в костях (в граммах) бедренной кости мышей с травмой спинного мозга, проведенный с помощью двухэнергетической рентгенографии. Сравнение проводилось между мышами через 40 дней после операции и контрольной группой здоровых мышей соответствующего возраста. Была отмечена значительная потеря содержания минеральных веществ в костях (на 12%) у мышей с травмой спинного мозга по сравнению с контрольной группой.

Здесь представлен анализ минеральной плотности кости в мг/см² при использовании двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии в бедренной кости мышей с травмой спинного мозга через 40 дней после повреждения в сравнении с контрольной группой здоровых мышей того же возраста. Снижение минеральной плотности кости не было статистически значимым, однако наблюдалась тенденция, схожая с изменением общего содержания минералов в костной ткани. После освоения метода процедура может быть выполнена за 20–30 минут, однако важно помнить о необходимости правильного позиционирования задних конечностей.

После просмотра этого видео вы получите представление о том, как проводить лонгитюдную оценку плотности костной ткани живых животных после травмы спинного мозга с помощью прибора Lumina XR компании Caliper Instruments.